出生後初期の発達におけるエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーのマウスモデルからの単一の筋繊維の分離と培養

すべての実験手順は、イタリア保健省および制度的動物管理使用委員会(認可n83/2019-PR)の倫理的承認の下で行われた。動物はイタリアのミラノのサン・ラファエレ病院の認可施設で維持された(認可n.N.127/2012-A)。 1. 筋解剖と筋繊維培養 機器の準備。 開始する前に、表 1に記載されているとおりに、必要なソリューションをすべて準備します。これらのソリューションは、新たに準備する必要があります。 70%エタノールで手順中に使用されるすべての表面とツールを洗浄します。 マウスの犠牲を始める前に、馬の血清(HS)を使用して100ミリメートルと35ミリメートルペトリ皿のコーティングを行います。ミオファイバーがプラスチックに取り付けないように、すべての皿をコーティングします。1匹の100mm皿とマウスあたり4つの35mm皿を使用することを検討してください。 HSの余分を除去した後、37°Cのインキュベーターに30分間コーティングされた料理を保管してください。次に、洗浄液または培養液(マウスあたり2つの35mm皿)で満たします。注:または、Dulbeccoの変更されたイーグルの媒体(DMEM)の10%HSの溶液は皿をコーティングするために使用することができる。常にコーティングされた料理を使用してください。異なるサイズの文化料理を使用することは可能ですが、小さな次元のペトリ料理をお勧めします。 繊維の分離のために、図2に示すように無菌パスツールピペットを準備する。各マウスに対して、筋肉処理と機械的分解用の1つの大きな穴孔ボアピペット(図2A)と繊維選択用の小孔ピペット1個を準備する(図2B)。ダイヤモンドペンを使用して各ガラスピペットを所望の長さにカットし、炎の上にピペットの縁を滑らかにします。 使用前にHSで短時間濡らして各ピペットをコーティングします。 マウスの犠牲と筋肉解剖 消化液を室温で10分間事前に温めてから、解剖手順を開始します。ポリプロピレンFACSラウンドボトムチューブは、目的に最も適した容器です。 筋肉の検索の開始の直前に, 適切な国家IACUC勧告に従ってマウスを犠牲に. 皮を切る前に70%エタノールで下半身を濡らして、毛髪の除去を容易にします。 アルミニウム紙で覆われたポリスチレンの支持体にマウスを置き、背中の真ん中から脚の方向に皮膚を切ります。 筋肉や腱に触れずに皮膚を慎重に取り除きます。すべての皮膚をはぎ取ることは可能です。 マウスの2本の脚を切り、急速に解剖を進める。注:より快適であれば、マウス全体の解剖を続けることは可能ですが、脚に取り組むことは後のカットでより多くの移動性と精度を可能にします。 ピンを使用して足のレベルでサポートの脚を修正し、この順序で関心のある骨格筋の分離を開始:TA、EDL、胃腸およびソレウス。 足首の高さで鋭いトゥイザーでTAの下腱を持ち上げて切り、TA筋肉の周りのすべての細かいはさみで膝蓋骨のレベルで他の腱に切ります(図3A)。消化液に移す。 EDLの下側腱を持ち上げ、他の腱にそっと引き上げて他の筋肉から分離します。切って消化液に入れる。メモ:EdLはTAとは別にカットする非常に小さいので、一緒に解剖することができます(図3B)。次に、筋肉全体が大きすぎる場合は、腱から始まり、繊維を縦方向に2〜3個に切ります(図3C)。 背中の筋肉を示す脚を回転させ、ピンを使用して足を固定します。アキレ腱を持ち上げると、胃腸は自動的に他の筋肉から分離します。上腱は膝蓋骨の後ろに上がっています。それをカットし、消化に筋肉を追加します。 脚の外部腱を持ち上げて(身体に関して)、ソレウスを手に入れる。ツイーザーで下をスクロールして、他の筋肉からそっと分離します。 他の脚にも同じ操作を行います(1.2.7.から1.2.11へのステップ)。 筋肉の消化 37°Cの水浴中に全ての筋肉を含む消化液を約45~50分間インキュベートします。消化時間中に、定期的に過剰消化を避けるために筋肉をチェックします。10分ごとに消化管を10倍に反転し、エネルギッシュな動きをします(渦を避ける)。 筋肉が緩み始め、筋線維が見えるとき、消化を止めます。 消化時間の最後にサンプルを振ります。 消化を止めるには、消化懸濁液を10mLの洗浄液であらかじめ温めた100mmペトリ皿に慎重に移します。注:これは必然的に超収縮ミオファイバーの分離につながるので、筋肉の過剰消化を避けてください。通常、このプロトコルでは、ホモ接合変異マウスの筋肉は消化されるのに45分を要し、野生型マウスの筋肉は50〜55分かかります。 単一のミオファイバー分離 まず、コーティングされたP200ピペットまたは小さな穴パスツールで個別に摘み取ることによって解剖顕微鏡の下で解離した繊維を分離し、100 mmペトリから5 mLの事前温め洗浄液を備えた新しい35mmペトリ皿に移します。 さらにミオファイバーを放出するために、繊維が機械的に放出されるまで、暖かい媒体を有する大孔孔孔ガラスピペットを用いて筋肉を上下にピペット化する。これは、繊維を損傷をもたらすので、あまりにも永続的にしないでください。 皿が望ましい量を含むまで筋肉から筋繊維を放出し続ける。ペトリ皿を室温で8分以上保つ場合は、停止して37°Cで最低5分間インキュベーションを行い、5%CO2を培地2を再平衡化する。 単一のミオファイバーを培養培地に移す前に、37°C、5%CO2を2洗浄皿に1時間以上放置する。これは、インビトロの状態に適応するためにミオファイバーを助けます.注意:大人の筋繊維はストレスの影響を受けにくく、洗浄することができます〜2〜3倍。しかし、この状態(出生後19日で)は、ミオファイバーの損傷を防ぐために1つの洗浄工程のみを行う方が良い。そのため、常にデブリや高収縮繊維を運びないようにして、選択したミオファイバーを十分に清潔に保つように注意してください。 単一のミオファイバー培養 適切な培養培地を用いて個々のミオファイバーを新しいプリ温め皿に移す(高血清培地は、衛星細胞の活性化を可能にする、図1参照)。 培地を単離されたミオファイバーに変え、新しい培養培地で新しいコーティングされた皿に移すことによって、48〜72時間後の培養後にのみ、筋繊維の過収縮および破壊につながるストレスを避ける。 2. 下流用途:ミオファイバー架橋と蛍光免疫 注意:ミオファイバー関連衛星細胞は、対象時に免疫蛍光(IF)で可視化することができます。公開されたプロトコルのほとんどは、成人の筋繊維上でIFを実行するように最適化されているので、ここでは、出生後の筋肉から隔離された筋繊維にも信頼性の高い結果を得るための詳細なプロトコルが提示されています。 ミオファイバー架橋 開始する前に、表 2に記載されているとおりに、必要なソリューションをすべて準備します。 サンプル数と同じ数のHSのマイクロ遠心分離管とのプレコート。続行する前に、必ずすべての HS を削除してください。架橋繊維は生きた繊維よりも厳しく、ピペットが難しいため、チューブごとに200~300本程度の繊維を別々に架橋するようにしてください。 解剖顕微鏡の下で、健康と見なすことができるすべての繊維を収集し、マイクロ遠心チューブに移し、チューブをインキュベーターの内側に5分間垂直にして、繊維が落ち着くようにします。 チューブから非常にゆっくりと上澄み出しを取り除く。 4%パラホルムアルデヒド(PFA)の1 mLをチューブにRTに加えて架橋繊維。繊維の苦痛を避けるために穏やかにそれを行います。 架橋時に繊維が織り交ぜるのを防ぐために、チューブを10分間非常に穏やかな攪拌状態に保ちます。 繊維が沈降するようにRTで5分間垂直位置にチューブを保ち、PFAボリュームの大部分を除去することを保証する上清を捨てます。 リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を1 mL加え、繊維を沈積物にするためにRTで5分間チューブを垂直に保ちます。 上清を取り除き、洗浄手順(ステップ2.1.8.)を2回繰り返します。 クロスリンクされたサンプルを4°Cに保ちます。メモ:4°Cで1週間、架橋したミオファイバーを保つことができます。この状態で繊維が1週間以上残っている場合、これは必然的にミオファイバーが絡み合う結果になります。 免疫蛍光 繊維沈沈を可能にするために、少なくとも5分間RTで立っている繊維を含む管を保ちます。 上清を取り除き、少量のボリュームを残して繊維を取り除かないようにします。 PBSに0.5%トリトンX-100の1mLを加え、穏やかな攪拌で5分間インキュベートします。 チューブを垂直に5分間置き、上清を取り除きます。 PBSを1.5mL加え、5分間穏やかな攪拌でインキュベートします。 チューブを垂直に5分間保持し、上清を取り除きます。 1 mLのブロッキング溶液を加え、穏やかな攪拌でRTで1時間インキュベートします。 チューブを垂直位置に5分置いてから、上清を取り除きます。 ブロッキング溶液中の一次抗体を希釈し、チューブに加え、穏やかな攪拌で4°Cで夜を過ごしてインキュベートする(推奨濃度については材料表を参照)。注:あるいは、一次抗体はRTで3時間インキュベートすることができます。しかし、一晩のインキュベーションは最適な染色を与えた。一次抗体と二次抗体の両方のインキュベーション体積は、沈み込み繊維が1.5 mLマイクロ遠心分離チューブの100 μLノッチに達すると300 μLになります。繊維の量が少ない場合は、100~200μLの体積をお勧めします。 チューブを垂直位置に5分間放置してから、上清を取り除きます。 PBSで0.25%Tween-20の1mLで3回の洗い物を行い、穏やかな攪拌で5分間インキュベートし、チューブを毎回5分間放置します。注:ここから、フルオロクロムの漂白を避けるために、暗闇の中ですべての手順を実行します。 ブロッキング溶液中の二次抗体を希釈し、チューブに加えて、RTで1時間、穏やかな攪拌を行ってインキュベートする(濃度については材料表を参照)。 PBSで0.1%のTween-20の1mLで2回洗浄し、穏やかな攪拌で5分間インキュベートし、チューブを5分間放置します。 上清を取り除き、DAPI溶液を1mL加え、穏やかな攪拌で5分間インキュベートします。 チューブをラック内に5分間垂直に立たせてから、上清を取り外します。 PBSを1 mLで洗浄し、穏やかな攪拌で5分間インキュベートし、チューブをラックに5分間放置します。 上清を取り除き、約50μLのボリュームを残します。 顕微鏡スライド上に蛍光標識されたミオファイバーの取り付け P200ピペットチップをカットし、ブロッキング溶液でコーティング注:先端をコーティングするには、繊維を選ぶ前に溶液を数回上下にピペットし、先端の壁に繊維が付着するのを避けます。 チューブから繊維を収集し、顕微鏡のガラススライド上に広げます。 解剖顕微鏡の下で、ミラーによって反射された自然光のみを使用して、新しい(カットされていない)P200ピペットチップを使用して繊維を広げ、余分な液体溶液を除去する。 非常に低い量の溶液が残るまで、スライドを暗闇の中で約10〜15分間乾燥させておきます。 取り付け媒体をスライドに追加し(適切な土台量はカバースリップの寸法で較正する必要があります:24 x 40 mmカバースリップの場合は20 μLで十分です)、ゆっくりとカバーガラスをファイバーを含む領域に置きます。メガネの間に泡を作らないように注意してください。 カバースリップを押して、繊維が単一の水平計画に置かるようにします。 マニキュアを使用してカバースリップを固定します。 サンプルを4°Cで最大4週間保存してください。 蛍光標識されたミオファイバーの望ましい画像を共焦点顕微鏡で取得します。