تدخل الحمض النووي الريبي في الخنافس المائية كأداة قوية للتلاعب التعبير الجيني في نقاط زمنية تنموية محددة
Summary
تدخل الحمض النووي الريبي هو أسلوب قابل للتطبيق على نطاق واسع وقوية للتلاعب التعبير الجيني في مراحل تنموية محددة. هنا، ونحن وصف الخطوات اللازمة لتنفيذ هذه التقنية في الغوص المائية خنفساء Thermonectus marmoratus، من الحصول على تسلسل الجينات إلى الضربة القاضية من الجينات التي تؤثر على هيكل أو السلوك.
Abstract
لا يزال تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) تقنية قوية تسمح بالتخفيض المستهدف للتعبير الجيني من خلال تدهور الحمض النووي الريبي الريبي . هذه التقنية قابلة للتطبيق على مجموعة واسعة من الكائنات الحية وكفاءة عالية في النظام الغنية بالأنواع Coleoptera (الخنافس). هنا، نلخص الخطوات اللازمة لتطوير هذه التقنية في كائن حي جديد ونوضح تطبيقها على المراحل التنموية المختلفة لخنخة الغوص المائية Thermonectus marmoratus. ويمكن الحصول على تسلسلات الجينات المستهدفة بفعالية من حيث التكلفة من خلال تجميع النسخ ضد قريب مع الجينوم المعروفة أو دي نوفو. يستخدم استنساخ الجينات المرشحة متجه استنساخ محدد (pCR4-TOPO plasmid)، والذي يسمح بتوليف الحمض النووي الريبي المزدوج (dsRNA) لأي جين مع استخدام التمهيدي واحد مشترك. يمكن حقن الـ dsRNA المركبة في الأجنة إما لعمليات النمو المبكرة أو اليرقات لعمليات النمو اللاحقة. ثم نوضح كيف يمكن حقن RNAi في اليرقات المائية باستخدام الجمود في agarose. لشرح هذه التقنية، ونحن نقدم أمثلة عدة من التجارب RNAi، وتوليد الضربات القاضية محددة مع الأنماط الظاهرية المتوقعة. على وجه التحديد، RNAi للزلغة الجين laccase2 يؤدي إلى تفتيح البشرة في كل من اليرقات والبالغين، وRNAi لبيض جين تصبغ العين تنتج البرق / عدم التصبغ في أنابيب العين. بالإضافة إلى ذلك ، يؤدي الضربة القاضية لبروتين العدسة الرئيسي إلى اليرقات مع نقص بصري وانخفاض القدرة على اصطياد الفريسة. مجتمعة، وهذه النتائج تجسد قوة RNAi كأداة للتحقيق في كل من النقش المورفولوجية والصفات السلوكية في الكائنات الحية مع قواعد البيانات النسخية فقط.
Introduction
مسألة كيفية الجينات محددة تسهم في تطور الصفات المتنوعة هو موضوع مثير في علم الأحياء. على مدى العقود القليلة الماضية، وقد أحرز تقدم كبير فيما يتعلق بتشريح الأسس الوراثية للعمليات التنموية في الكائنات نموذج قليلة، مثل الخيطية Caenorhabditis elegans، ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster، والمنزل موسكولوس موسكولو ماوس1. في الآونة الأخيرة ، اختراع تقنيات قوية لتحرير الجينات مثل متفاوتة المسافات بانتظام يكرر palindromic قصيرة (CRISPR) / Cas92 وفرت القدرة على تغيير الشفرة الجينية للكائنات غير النموذجية (لأمثلة انظر3،4). ونتيجة لذلك، حدثت طفرة في الدراسات الجينية على مجموعة متنوعة من الكائنات الحية التي لم تكن قد تم تناولها من قبل من خلال التقنيات الجزيئية. وبالنظر إلى التنوع الهائل في مملكتنا الحيوانية، مع العديد من الصفات المثيرة للاهتمام أو الاختلافات سمة التي يتم تمثيلها فقط في أنواع محددة، جعلت هذا التقدم هو وقت مثير لعلم الأحياء التطوري والتنموي (“إيفو-ديفو”) العمل ذات الصلة. ومع ذلك، فإن تقنيات تحرير الجينوم المتاحة للكائنات غير النموذجية مقيدة نسبياً فيما يتعلق بالنقاط الزمنية التنموية التي يمكن تطبيقها عليها، مما يجعل من الصعب تمييز الخصائص الزمنية المرتبطة بالدور الذي تلعبه الجينات المحددة في أي سمة. بالإضافة إلى ذلك، غالباً ما تقتصر التقنيات المعدلة وراثياً على الجينات غير الأساسية للبقاء على قيد الحياة (أي التي لا تؤدي الضربة القاضية إلى الفتك). ولذلك، فبينما بدأت تقنيات تحرير الجينات تصبح شائعة، لا تزال هناك حاجة إلى تقنيات فعالة قابلة للتطبيق على مجموعة متنوعة من الكائنات الحية المختلفة في نقاط زمنية تنموية محددة وتسهل الضربات القاضية الجزئية (بدلاً من فقدان الوظيفة بالكامل). هنا ، ونحن نلفت الانتباه إلى تدخل الحمض النووي الريبي (RNAi) ، وهو تاريخ بعض الشيء بعد قوية الجينات الأسلوب5 التي هي قيمة خاصة باعتبارها نهجا التآزر لتحرير الجينات. على وجه التحديد، وضعنا إجراءات تسمح بتطبيق RNAi على خنافس الغوص المائية كمثال يوضح تنفيذ هذه التقنية، من الحصول على التسلسلات الجزيئية اللازمة للحقن الناجح للرنا المزدوج (dsRNA) في البيض واليرقات.
RNAi المستندة إلى ضرب الجينات استفيد من آلية الدفاع الفطرية من الكائنات الحية، والتي جزيئات DSRNA تسهيل إسكات توالي الحمض النووي الغازية، مثل الفيروسات transposons6. باختصار، يتم تناول الـ dsRNA في الخلية، حيث يتم قطعها إلى 20-25 قطعة من النيوكليوتيدات بواسطة إنزيم الـ Dicer. ثم تقوم هذه القطع بتنشيط تشكيل مجمع إسكات الـRNA الذي يسببه الجيش الملكي النيبالي (RISC)، والذي يمنع الـ MRNA المستهدفة من خلال الربط معها في مواقع محددة باستخدام حبلا الدليل. هذه العملية تؤدي في نهاية المطاف إلى تدهور مرنا وبالتالي يتداخل مع ترجمة مرنا إلى البروتين6. ولذلك تعتمد تقنية الضربة القاضية للجينات المستندة إلى RNAi المقدمة هنا على حقن dsRNA. بالنسبة لنماذج الحيوانات، وقد وضعت هذه التقنية أصلا في C. elegans7 و D. الميلانوغاستر8 ولكن منذ ذلك الحين ظهرت كأداة وراثية وظيفية قوية في الكائنات غير نموذج9،10. نظرا لطبيعتها الفعالة للغاية في بعض الحشرات ، يمكن حتى تطبيق RNAi في إدارة الآفات11.
كأداة بحثية، تم استخدام RNAi لدراسة كيفية عمل المسارات الجزيئية والتنموية الرئيسية في نماذج الحشرات غير التقليدية. على سبيل المثال، RNAi في خنفساء الدقيق Tribolium castaneum كان له دور فعال في تحديد مدى الجينات المحافظة على عمق تسهم في سمات محددة في تلك الخنفساء، كما يتضح من أجل تطوير أجنحة على شكل خاص12،,13،,14 وعيون15،,16. وقد وصفت جيدا التقنيات التي تكمن وراء التلاعب في T. castaneum 17 وتعتمد على القدرة على شل البيض الجاف نسبيا واليرقات على سطح لزجة. غير أن هذا الجمود غير ممكن للأشكال التنموية الرطبة للكائنات المائية مثل الغوص الشمس بيتف ثيرمونكتوس marmoratus. كما هو الحال بالنسبة للعديد من الكائنات العضوية النموذجية غير التقليدية ، فإنه يفتقر إلى جينوم مشروح. للتلاعب بالتعبير الجيني في أي كائن حي بدون جينوم ، فإن الخطوة الأولى المعقولة والفعالة من حيث التكلفة هي توليد نسخ وتحديد تسلسلات النوكليوتيدات المفترضة للجينات المعبّر عنها ذات الاهتمام استنادًا إلى تشابه التسلسل مع الكائنات النموذجية ذات الصلة ولكن الأكثر رسوخاً ، في هذه الحالة ، جينات Tribolium (Coleoptera) و Drosophila.
هنا، لإظهار كيف يمكن استخدام RNAi على كائن مائي، ونحن نناقش أولا بروتوكولات وبرامج لاستخراج الحمض النووي الريبي وتوليد النسخ وتجميع، والتي تسمح لتحديد تسلسلات الجينات المستهدفة محددة. ثم نلخص الخطوات اللازمة لتجميع الحمض النووي الخاص بالجينات. في وقت لاحق، ونحن توضيح كيف يمكن حقن البيض في بيئة مائية، وتبين بروتوكولات الحضانة لتنمية الأجنة النامية. بالإضافة إلى ذلك ، نبين كيف يمكن استخدام جل agarose لشل حركة اليرقات تمامًا أثناء عملية الحقن ، وهي تقنية مفيدة بشكل عام خلال الإجراءات المختلفة ويمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من المفصليات. لشرح كيف يمكن تطبيق RNAi على مراحل النمو المختلفة، ونحن تشمل مثالا الذي إسكات العين تصبغ الجينات البيضاء في الأجنة. بالإضافة إلى ذلك ، نصف مثالًا تم فيه إسكات اللاكليهالجيني للدباغة2(lac2) خلال كل من اليرقات الثانية (للتأثير على يرقات اليرقات الثالثة من النجوم) وstar اليرقات الثالثة (للتأثير على البالغين). وأخيراً، نثبت أن حقن تركيز أقل من الـ dsRNA يؤدي إلى ضربة قاضية جزئية، مما يدل على أن هذه التقنية يمكن تطبيقها أيضًا على الجينات التي من المعروف أن فقدان الوظيفة فيها قاتل.
Protocol
Representative Results
Discussion
هدفنا هو أن هذا التجميع من الأساليب سيجعل RNAi متاحة على نطاق واسع ، خاصة وأن هذه الأداة لا تزال تقنية تآزرية قوية لتحرير الجينات CRISPR / Cas9 ، مع ميزة أنه يمكن تطبيقها على المراحل التنموية المطلوبة من الكائنات الحية المدروسة. ولمثل هذه القوة، حقننا الـ(ديسرنا) في الأجنة وفي مراحل يرقات مختلفة. أثرت الحقن في البيض على نمو الأجنة (الشكل 2)، وكان للحقن في مرحلة اليرقات الثانية آثار واضحة على المرحلة الثالثة من اليرقات(الشكل 4 والشكل 6)، وأظهرت الحقن في مرحلة اليرقات الثالثة آثارًا في البالغين (الشكل 5). في حين أن التوقيت الدقيق يجب أن يحدد تجريبيا, عموما, الحقن نافذة المفعول في غضون أيام قليلة. يمكن أن يتأثر نجاح هذه العملية بطول تسلسل DSRNA. هنا، عرضنا أمثلة باستخدام ما يزيد قليلا على 200 نقطة بريتيش بتروليوم إلى أكثر من 800 نقطة بريتيش بتروليوم. كقاعدة عامة، يتم تفضيل تسلسل بين 100 و 600 BP للحد من الآثار خارج الهدف، ولكن تسلسل يصل إلى 1000 bp العائد نتائج جيدة22. سؤال واحد فيما يتعلق RNAi هو مدة الضربة القاضية التي يمكن تحقيقها من خلال هذه التقنية. وبما أن الأنماط الظاهرية كانت نهائية في كل مرحلة، لا يمكننا التعليق على هذه المسألة بناءً على النتائج التي تم عرضها. ومع ذلك، فقد سبق أن لوحظ أن آثار RNAi عموما عمر طويل نسبيا، وأن تركيزات أعلى تؤدي إلى الضربات الهزية أطول أمدا20.
أحد القيود على هذه التقنية هو أنه يعمل بشكل أفضل لبعض الكائنات الحية من غيرها ، ويبدو أنه لا توجد طريقة مباشرة للتنبؤ بمدى نجاحها. ومع ذلك، فقد تبين أن العمل جيد بالنسبة لمجموعة كبيرة من الكائنات الحية المختلفة. داخل المفصليات ، وهذا يشمل arachnids26، القشريات27، ومجموعة متنوعة من الحشرات ، مع معدلات نجاح عالية بشكل خاص في الخنافس28. وهناك تعقيد آخر هو أن الاختلافات في شدة النمط الظاهري غالبا ما تحدث بين الأفراد على الرغم من تطبيق نفس الكمية من dsRNA. كما هو موضح في الشكل 2B، يمكن أن يحدث حتى الاختلاف داخل الفرد. في دراساتنا RNAi التي تستهدف جينات مختلفة تشارك في تطوير العين اليرقات T. marmoratus ، وجدنا في كثير من الأحيان أن بعض العيون تتأثر بشدة أكثر من غيرها. قد تكون هذه الظاهرة مرتبطة بالأنسجة الكثيفة نسبيًا من مجموعة العين ، مع DSRNA قادرة بشكل أفضل على الوصول إلى بعض الوحدات.
من المهم للغاية لتحسين تنفيذ تجارب RNAi بنجاح أن يتم تحسين عدة معلمات للجين المستهدف. على سبيل المثال، يمكن تركيز DSRNA وطول الجين المستهدف تؤثر بقوة على النتيجة20. معلمة أخرى حرجة هي كيفية تنفيذ الحقن، حيث يمكن أن تؤثر هذه العملية بشكل كبير على معدل البقاء على قيد الحياة. بالنسبة للأجنة، حققنا أفضل النتائج باستهداف مركز الجنين. لوحة مُضَمّرة جيداً تسمح بحقن 100 جنين أو أكثر في جلسة واحدة. بالنسبة لليرقات ، من المهم إدخال إبرة الحقن بين الأجزاء. تتطلب هذه الحقن المزيد من اليرقات، وبناء على توافر اليرقات، فإن مجموعات الحقن لدينا هنا تتكون عادة فقط من عدد قليل من الحيوانات في وقت واحد. لجميع الحقن ، من المهم منع الهواء من دخول الكائن الحي.
في بعض الحالات، يمكن أن تؤثر حلقات التغذية المرتدة لشبكة تنظيمية جينية والتكرار الوراثي على ازدواجية الأنماط الظاهرية RNAi، على الرغم من الضربات القاضية المتسقة. ويبدو أن هذا هو الحال بالنسبة لملاحظاتنا السلوكية من اليرقات مع الضربات القاضية ناجحة للغاية من بروتين عدسة بارزة، Lens318. على الرغم من أننا تحققنا من الكفاءة العالية لهذه الضربات القاضية من خلال qPCR ، لوحظ اختلاف كبير في الأنماط الظاهرية المرتبطة بها. هذه النتيجة تسلط الضوء على ضرورة تحديد بشكل صحيح RNAi knockdowns (للحصول على تفاصيل حول الخيارات انظر22). إذا لم يكن هناك توقع واضح مسبقًا فيما يتعلق بالنمط الظاهري الناتج ، فإن الطريقة الجيدة للتحكم في التأثيرات غير المستهدفة للرنابي هي استهداف نفس الجين بمسلسلين غير متداخلين من dsRNA وتقييم النتائج للنمط الظاهري الشائع.
وعلى النقيض من تقنيات تحرير الجينات، فإن RNAi هو أيضا أداة قوية لدراسة الجينات القاتلة، وهناك طريقتان للقيام بذلك. على سبيل المثال، إذا كان أحد مهتم بالمساهمة الوظيفية للجين حيث فقدان الوظيفة في وقت مبكر من التنمية هو معروف أن تكون قاتلة، يمكن تحقيق وظيفية من هذا الجين ببساطة عن طريق السماح للحيوان أن تتطور بشكل طبيعي ومن ثم هدم الجين عن طريق RNAi في وقت لاحق في التنمية (أي، في الكبار). وبدلاً من ذلك، يمكن التحقيق في جين يعرف أن فقدان الوظيفة بالكامل قاتلاً من خلال ضربة قاضية جزئية، وهو ما يمكن تحقيقه عن طريق حقن مجموعة من تركيزات الحمض النووي الريبي. تظهر بعض نتائجنا الضربات القاضية من اللاك2، والتي من المعروف أنها قاتلة إذا أصبح بشرة الحشرات ناعمة بشكل مفرط24. حتى خنفساء lac2 RNAi المصورة في الشكل 5 من غير المرجح أن تبقى خارج ظروف المختبر. يتم قطعجين آخر قاتل ، والتي رموز لعامل النسخ الذي هو أساسي لمواصفات الخلية مصير في أنظمة الجهاز المختلفة في المفصليات ، وقد تم ربطها بتطوير غليا في نظام Drosophila البصري29. استنادا إلى تجربتنا مع قطع RNAi في الأجنة T. marmoratus، يمكننا استحضار أنماط الظاهريات العين بالمعلومات في الأجنة التي هي قادرة على استكمال نمو العين الجنينية (ملاحظات غير منشورة). هنا, جرعات أعلى يبدو أن يؤدي إلى معدلات أعلى الفتك, في حين أن الجرعات المنخفضة تؤدي إلى أنماط ظاهرية ملحوظة وغنية بالمعلومات.
بروتوكولنا لا يسرد فقط الخطوات اللازمة للباحث لمتابعة تجارب RNAi على T. marmoratus، كما هو موضح ، ولكن ينطبق أيضًا بشكل عام على الكائنات الأخرى ، وخاصة الكائنات المائية. ومن بين الكائنات المائية، هناك بالفعل عدة أمثلة داخل القشريات مثل براغيث المياه دافنيا30 والجمبري (للاطلاع على استعراض حديث، انظر المرجع31). هناك فرص وافرة بين الحشرات المائية، حيث تشير التقديرات إلى أنها تشكل حوالي 6٪ من جميع تنوع الحشرات، مع احتمال أكثر من 200،000 نوع32. وعلاوة على ذلك، تم بالفعل تنفيذ RNAi على المياه الحادة التي تميل إلى أن تسكن سطح البيئات المائية33. إذا لم يكن هناك جينوم موجود ، ثم transcriptome يمكن تجميعها دي نوفو. طالما أن هذه العملية تكشف عن contigs من بضع مئات من النيوكليوتيدات، يمكن تصميم dsRNA ضد جينات محددة. ومن المرجح أن يكون بروتوكولنا لشل حركة الحشرات في أغاروز مفيدًا أيضًا لإجراءات أخرى ، خاصة بالنسبة للكائنات الناعمة والمرنة والمائية. وتبقى RNAi، مجتمعة، تقنية قوية للتلاعب في التعبير الجيني في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية، حتى عندما لا تتوفر أدوات جزيئية وجينية أخرى.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الدكتور جوش بنوا لمساعدته في المعلوماتية الحيوية هايلي توبلر لمساعدتها في رفع خنافس الغوص Sunburst وتمارا بيس للحصول على المساعدة التحريرية. وقد تم دعم هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم في إطار المنح IOS-1456757 و IOS-1856341 إلى EKB و IOS157936 إلى YT.
Materials
| 1. RNA isolation and de novo transcriptome assembly | |||
| liquid nitrogen | University Stockroom | Typically locally available at research institutions | |
| pipette tips | Fisher Scientific | size dependent | Products from other vendors would work equally well |
| RNeasy lipid tissue mini kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 74804 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| 1.2. De novo transcriptome assembly. | |||
| BUSCO.v3 | https://busco.ezlab.org/ | Any freely available software for assessing trasncriptome completeness can be used. | |
| CLC Genomics workbench | Qiagen | 832021 | Other equivalent software packages are also available |
| Galaxy workbench | https://usegalaxy.org/ | An open source online transcriptome assembly & annotation pipeline | |
| NCBI BLASTx | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?LINK_LOC=blasthome&PAGE_TYPE=BlastSearch&PROGRAM=blastx | An open source online alignment and annotation pipeline | |
| 2. cDNA synthesis, Cloning & Miniprep isolation | |||
| ampicillin sodium salt | Gibco | 11593-027 | Products from other vendors would work equally well |
| glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | Products from other vendors would work equally well |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | Products from other vendors would work equally well |
| Omniscript RT (reverse trasncription) kit | Qiagen | 205111 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| One Shot™ TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | ThermoFischer | 771471 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| shaker-incubator | Labnet | 211DS | Other models would work equally well |
| spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| thermal cycler for PCR | BioRad | T100 | Other models would work equally well |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | 1845069 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| X-Gal Solution | Thermo Scientific | R0941 | Products from other vendors would work equally well |
| 2.2 PCR amplification & in vitro dsRNA synthesis | |||
| Centrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17R | Other models would work equally well |
| ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Products from other vendors would work equally well |
| FastTaq DNA Polymerase, dNTPack | Roche | 13873432 | This kit contains all the reagents necessary for a PCR |
| MEGAclear Transcriiption clean up kit | ThermoFischer | AM1908 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| MEGAscript T7 Transcription kit | ThermoFischer | AM1334 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9932 | Products from other vendors would work equally well |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| sodium acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | Make 3M working solution |
| Spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| 3. Collecting and preparing early stage T. marmoratus embryos for dsRNA injections | |||
| agarose | Fisher Scientific | 9012-36-6 | Products from other vendors would work equally well |
| distilled water | Fisher Scientific | 9180 | Products from other vendors would work equally well |
| forceps (Dumon #4 Biology) | Fine Science Tools | 11242-40 | Products from other vendors would work equally well |
| glass cavity dish (3 well-dish) | Fisher Scientific | 50-243-43 | Products from other vendors would work equally well |
| microwave | Welbilt | turn-table | Other models would work equally well |
| natural hair paintbrush | Amazon | Any fine brush will do | |
| P1000 micro-pipetter | Gilson | F123602 | Other models would work equally well |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
| transfer pipettes | Fisher Scientific | 21-200-109 | Products from other vendors would work equally well |
| 4. dsRNA micro-injections in early stage T. marmoratus embryos | |||
| digital camera | Edmund optics (Qimaging) | Retiga 2000R | Other models would work equally well |
| ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Products from other vendors would work equally well |
| food dye | Kroger | Any available food dye should work fine | |
| humidity chamber | take any plastic box with a lid, sterilize it with 70% ethanol and let it dry | ||
| incubator | Labline | 203 | Other models would work equally well |
| injection buffer | Prepared for 1 mL following reference #22 : Mix 10 µL of 0.1 M sodium phosphate buffer, 100 µL of 0.5 M potassium chloride solution, 100 µL of food dye and 790 µL of double-distilled water. Store in 4 °C. | ||
| intracellular Microinjection Systems (Picospritzer) | Parker | 052-0500-900 | Currently the model III is available, but older models work also |
| micro needle holder | A-M Systems | 672441 | Other products would work equally well |
| microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| micromanipulator | Drummond Scientific Company | 3-000-024-R | Any quality micromanipulator will work |
| monosodium phosphate | Fischer scientific | 7558-80-7 | To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.2 g of monosodium phosphate powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained |
| P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700. |
| P10 micro-pipetter | Gilson | F144802 | Other models would work equally well |
| P1000 micro-pipetter | Gilson | F123602 | Other models would work equally well |
| potassium chloride | Fischer scientific | 7447-40-7 | To make 100 mL of 0.5 M potassium chloride solution: Add 3.73 g of potassium chloride crystals to 100 mL of double distilled water and mix until clear solution is obtained. |
| sodium phosphate buffer (0.1M) | To make 10 mL of 0.1 M of this buffer: Mix 8.5 mL of 1 M sodium phosphate dibasic solution with 1.5 mL of 1 M monosodium phosphate solution. Check the pH with a pH meter and adjust accordingly to pH 7.6 at room temprature. | ||
| sodium phosphate dibasic | Fischer scientific | 7558-79-4 | To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.42 g of sodium phosphate dibasic powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
| 5. Preparing T. marmoratus larvae for dsRNA injections | |||
| agarose | Fisher Scientific | 9012-36-6 | Products from other vendors would work equally well |
| forceps (Dumon #4 Biology) | Fine Science Tools | 11242-40 | Products from other vendors would work equally well |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| 6. dsRNA micro-injections in T. marmoratus larvae | |||
| injection buffer (10x) | See section 4 | ||
| microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| microinjection syringe | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| micro needle holder | A-M Systems | 672441 | Other products would work equally well |
| P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700. |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
References
- Muller, B., Grossniklaus, U. Model organisms – A historical perspective. Journal of Proteomics. 73, 2054-2063 (2010).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell. 154, 442-451 (2013).
- Westerman, E. L., et al. Aristaless Controls Butterfly Wing Color Variation Used in Mimicry and Mate Choice. Current Biology. 28, 3469 (2018).
- Perry, M., et al. Molecular logic behind the three-way stochastic choices that expand butterfly colour vision. Nature. 535, 280 (2016).
- Boettcher, M., McManus, M. T. Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Molecular Cell. 58, 575-585 (2015).
- Meister, G., Tuschl, T. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature. 431, 343-349 (2004).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
- Mello, C. C., Conte, D. Revealing the world of RNA interference. Nature. 431, 338-342 (2004).
- Agrawal, N., et al. RNA interference: Biology, mechanism, and applications. Microbiol. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67, 657 (2003).
- Gu, L. Q., Knipple, D. C. Recent advances in RNA interference research in insects: Implications for future insect pest management strategies. Crop Protection. 45, 36-40 (2013).
- Ravisankar, P., Lai, Y. T., Sambrani, N., Tomoyasu, Y. Comparative developmental analysis of Drosophila and Tribolium reveals conserved and diverged roles of abrupt in insect wing evolution. Developmental Biology. 409, 518-529 (2016).
- Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum. Nature. 433, 643-647 (2005).
- Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. Repeated Co-options of Exoskeleton Formation during Wing-to-Elytron Evolution in Beetles. Current Biology. 19, 2057-2065 (2009).
- Yang, X., et al. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II): The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless. Developmental Biology. 333, 215-227 (2009).
- ZarinKamar, N., et al. The Pax gene eyegone facilitates repression of eye development in Tribolium. Evodevo. 2, 15 (2011).
- Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borras-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum. Journal of Visualized Experiments. , e52059 (2014).
- Stahl, A., S, B. R., Cook, T. A., Buschbeck, E. K. A complex lens for a complex eye. Integrative and Comparative Biology. 57, 1071-1081 (2017).
- Yeku, O., Frohman, M. A. Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE). RNA, Methods In Molecular Biology. , 107-122 (2011).
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting Systemic RNA Interference in the Red Flour Beetle Tribolium castaneum: Parameters Affecting the Efficiency of RNAi. Plos One. 7, (2012).
- Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214, 575-578 (2004).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y., Orgogozo, V., Rockman, M. V. . Molecular Methods for Evolutionary Genetics. , 471-497 (2011).
- Mackenzie, S. M., Howells, A. J., Cox, G. B., Ewart, G. D. Sub-cellular localisation of the White/Scarlet ABC transporter to pigment granule membranes within the compound eye of Drosophila melanogaster. Genetica. 108, 239-252 (2000).
- Arakane, Y., Muthukrishnan, S., Beeman, R. W., Kanost, M. R., Kramer, K. J. Laccase 2 is the phenoloxidase gene required for beetle cuticle tanning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 11337-11342 (2005).
- Werner, S., Buschbeck, E. K. Rapid and step-wise eye growth in molting diving beetle larvae. Journal of Comparative Physiology. 201, 1091-1102 (2015).
- Prpic, N. M., Schoppmeier, M., Damen, W. G. Gene Silencing via Embryonic RNAi in Spider Embryos. Cold Spring Harbor protocols. 3, 1-4 (2008).
- Sagi, A., Manor, R., Ventura, T. Gene Silencing in Crustaceans: From Basic Research to Biotechnologies. Genes. 4, 620-645 (2013).
- Zhu, K. Y., Palli, S. R., Douglas, A. E. . Annual Review of Entomology. 65, 293-311 (2020).
- Bauke, A. C., Sasse, S., Matzat, T., Klaembt, C. A transcriptional network controlling glial development in the Drosophila visual system. Development. 142, 2184 (2015).
- Lin, C. Y., et al. RNAi analysis of doublesex1 expression in Daphnia pulex Leydig, 1860 (Cladocera). Crustaceana. 92, 137-154 (2019).
- Nguyen, D. V., Christiaens, O., Bossier, P., Smagghe, G. RNA interference in shrimp and potential applications in aquaculture. Reviews in Aquaculture. 10, 573-584 (2018).
- Dijkstra, K. D. B., Monaghan, M. T., Pauls, S. U., Berenbaum, M. R. . Annual Review of Entomology. 59, 143-163 (2014).
- Crumiere, A. J. J., Khila, A. Hox genes mediate the escalation of sexually antagonistic traits in water striders. Biology. Letters. 15, 5 (2019).
