Interférence de l’ARN dans les coléoptères aquatiques comme un outil puissant pour manipuler l’expression des gènes à des points de temps de développement spécifiques

1. Isolation de l’ARN et assemblage de novo transcriptome Effectuer l’isolement total de l’ARN à partir des tubes oculaires larvaires du coléoptère de plongée tardive et des coléoptères adultes à l’aide d’un kit d’isolement de l’ARN(voir tableau des matériaux) conçu pour les tissus riches en lipides. Isoler l’ARN total de T. marmoratus et le séquencer suivant les méthodes précédemment décrites18. Assemblage de transcription de novoREMARQUE : Pour assembler le transcriptome de novo, diverses plates-formes bioinformatiques peuvent être utilisées (voir tableau des matériaux). Ces plates-formes sont disponibles dans le commerce et, dans certains cas, existent sous forme de scripts de ligne de commande unix. Étant donné que l’assemblage est de novo, il est recommandé d’assembler les transcriptomes indépendamment sur deux plates-formes et de comparer les résultats pour exclure les faux positifs ou les faux négatifs. Pour commencer à assembler les transcriptomes, téléchargez les lectures brutes sur la plate-forme bioinformatique respective.REMARQUE : Ces fichiers sont généralement compressés et au format FASTQSANGER. Gz. Il n’est pas nécessaire de décompresser les fichiers car ce format est accepté à l’étape suivante. À l’aide de la ligne de commande Trimomatic, coupez les lectures brutes pour supprimer les séquences d’adaptateur ou les lectures courtes qui tombent en dessous du seuil par défaut. Décompresser les lectures brutes parées; les fichiers seront maintenant au format FASTQ. Concatenate les lectures brutes FASTQ pour chaque échantillon pour obtenir des fichiers qui sont prêts pour l’assemblage de novo. Assemblez les lectures brutes concatnées de novo à l’aide de n’importe quel script de ligne de commande qui peut assembler des transcriptomes de novo. Enregistrez le transcriptome assemblé, qui aura maintenant une liste de contigs avec leurs séquences respectives, comme un fichier FASTA. Pour augmenter la couverture de l’assemblage, combinez et assemblez plusieurs transcriptomes pour la même espèce.REMARQUE : Ce processus augmente les chances de générer des contigs plus précis et est particulièrement important si les gènes à faible nombre de copies sont intéressants. Une fois assemblé, évaluez le transcriptome pour déterminer l’exhaustivité en calculant les scores de couverture (le logiciel d’évaluation de la couverture est librement disponible, voir Tableau des matériaux).REMARQUE : Un transcriptome avec un score de couverture >75% est considéré comme bon. Cependant, la pertinence de cette partition dépend de la raison de la génération de transcription. Par exemple, si le transcriptome est utilisé pour identifier les gènes à faible nombre de copies, alors un score >85% est mieux, car il signifie une plus grande couverture. Annoter le transcriptome de novo assemblé à l’aide d’un outil de recherche d’alignement local de base (BLAST; voir Table of Materials).REMARQUE : Pour cette expérience, le transcriptome a été annoté principalement sur une base de données de protéines connues de la Drosophila et une base de données de protéines connues du coléoptère. La liste des annotations peut être téléchargée sous forme de fichier feuille de calcul et de contigs/contigs qui indiquent la similitude de la séquence avec les protéines d’autres organismes peut être téléchargée sous forme de fichier FASTA. Identifier le nombre/nombre de contig de la protéine d’intérêt et extraire les séquences de nucléotides. Utilisez BLAST pour déterminer si des régions conservées spécifiques aux protéines (telles que les domaines homeobox) sont présentes dans la séquence d’intérêt des nucléotides annotés. Vérifiez d’autres contigs avec la même annotation pour les chevauchements de séquences de nucléotides pour générer la séquence d’une transcription spécifique au gène.REMARQUE : Il n’est généralement pas possible d’identifier les contiges avec le chevauchement des séquences pour tous les gènes, en particulier pour les gènes à faible nombre de copies. Si la séquence complète du gène est nécessaire, commencez par le contig qui a la similitude de séquence la plus élevée comme point d’initiation pour identifier la séquence nucléotidique de la transcription mature entière en utilisant des techniques telles que 3′ et 5′ amplification rapide des extrémités de l’ADNC (RACE19). Annoter l’assembly obtenu à partir de la deuxième plate-forme suivant les étapes 1.2.4–1.2.7.REMARQUE : Idéalement, les résultats devraient être similaires pour les protéines d’intérêt; toutefois, la couverture peut différer d’une certaine forme à l’autre. Utilisez le transcriptome assemblé pour synthétiser l’ARSD spécifique à l’espèce, tel qu’indiqué à la section 2. 2. Clonage et synthèse d’ARN spécifique aux gènes REMARQUE : Le clonage spécifique aux gènes et la synthèse de l’ARN a été décrit en détail pour T. castaneum20,21,22. Les étapes suivantes sont un bref aperçu. Clonage, transformation bactérienne et séquençage du plasmide Isoler l’ARN total de l’organisme (tel que décrit à l’étape 1.1) et créer de l’ADN complémentaire (ADC) à l’aide d’unkit de transcription inversée (voir tableau des matériaux). Identifiez une ou deux séquences nucléotides de 100 à 1000 pb à partir de contigs spécifiques aux gènes d’intérêt. Concevoir des paires d’amorces couvrant l’ensemble de l’étendue identifiée des nucléotides et amplifier la séquence par une réaction en chaîne de polymérase (PCR). Ajoutez une étape supplémentaire de 30 min à la fin pour créer des surplombs d’adénine de 3′ dans le produit d’ADN amplifié. Purifier ce produit à l’aide d’un kit de purification PCR (voir Tableau des matériaux). Clonez le produit purifié dans un vecteur plasmide pCR4-TOPO (voir tableau des matériaux)suivant le protocole du fournisseur fourni avec le kit de clonage. L’utilisation d’un traitement par choc thermique transforme les plasmides clonés en cellules bactériennes compétentes (souche : E. coli DH10B) suivant le protocole du fournisseur pour les cellules compétentes (voir tableau des matériaux)et dépistez les cellules transformées avec succès.REMARQUE : Les plaques avec colonies peuvent être enveloppées dans un film de paraffine pour retenir l’humidité et stockées à 4 °C pendant un mois. Choisissez des colonies de cellules transformées à l’aide d’une pointe de pipette de 10 μL et de la culture dans le bouillon de lysogénie (LB) contenant de l’ampicilline (50 μg/mL) dans un shaker-incubateur à 37 °C et 200 tr/min pendant 24 h.REMARQUE : Pour le stockage à long terme, les cellules cultivées peuvent être diluées 1:1 avec 100% glycérol et congelées à -80 °C sous forme de stocks de glycérol. Isoler les plasmides contenant le gène d’intérêt de cette culture à l’aide d’un kit d’isolement miniprep (voir tableau des matériaux). Stockez les plasmides isolés (minipreps) à -20 °C après évaluation du rendement spectrophotométriquement. Plus précisément, mesurer l’absorption de l’échantillon à 260 nm, 280 nm et 230 nm. Calculer les ratios A260/A280 pour la quantification de l’ADN, et A260/A230 pour quantifier la pureté de l’ADN.REMARQUE : Un rapport de 260/280 de 1,8 est généralement accepté comme adn suffisamment pur, des ratios inférieurs à 1,5 indiquent la présence de réactifs résiduels d’extraction tels que le phénol. Le ratio 260/230 devrait être supérieur ou égal au ratio 260/280. Des ratios plus faibles indiquent une contamination résiduelle par les réactifs. Le rendement varie généralement de 100 à 500 ng/μL. Séquencer les minipreps isolés pour confirmer que le fragment spécifique au gène a été intégré avec succès, étant flanqué entre 5′ T7 et 3′ T3 régions promotrices dans le plasmide; cela peut être fait à l’aide d’amorces universelles de séquençage T7 et T322. Utilisez les minipréps avec la séquence d’intérêt spécifique au gène pour la préparation de l’ARN. Amplification pcr et synthèse in vitro d’arna Amplification et purification des produits PCR Concevoir des amorces spécifiques au plasmide ou spécifiques aux gènes qui ont la séquence de promoteur T7 sur leurs côtés de 5′ (voir référence22 pour plus de détails) pour amplifier un fragment linéaire du gène inséré. Optimisez le rendement en mettant en place au moins 10 réactions de 20 μL chacune.REMARQUE : Le produit qui en résulte est flanqué de deux sites de liaison T7 de la polymérase de 20 pb. Purifier le produit PCR à l’aide d’un kit de purification de produit PCR (voir tableau des matériaux),suivant le protocole d’ellion basé sur la colonne du fournisseur. Pour augmenter le rendement, répétez l’étape finale d’ellion jusqu’à 3 fois avec le même eluent. Évaluer le rendement spectrophotométriquement.REMARQUE : Le rendement varie habituellement de 100 à 700 ng/μL. Ce produit purifié peut être stocké à -20 °C jusqu’à ce qu’il soit utilisé davantage. Synthèse et purification de l’ARN Utilisez le produit purifié PCR spécifique au gène pour synthétiser le dsRNA in vitro selon le protocole d’un kit de synthèse d’ARN de choix. Si nécessaire, prolongez le délai d’incubation pour augmenter la production d’ARN. Évaluer la progression de la réaction en fonction de l’opacité du mélange de réaction (plus la quantité du produit dsRNA est élevée, plus la turbidité est élevée). À la fin de l’incubation, arrêter la réaction en utilisant un traitement DNase. Pour ce faire, ajouter 1 μL d’un stock de 2 U/ μL, au mélange de réaction. Étendre ce traitement à 1 à 2 h pour assurer la dégradation optimale de l’ADN du modèle. Purifier le dsRNA avec un kit de purification ou par les étapes suivantes. Diluer le produit résultant avec 115 μL d’eau sans nucléase et ajouter 15 μL d’acétate de sodium de 3 M. Ajouter 2 volumes d’éthanol 100% glacé à ce mélange de réaction et précipiter le dsRNA pendant la nuit à -20 °C.REMARQUE : À ce stade, les échantillons peuvent être stockés en toute sécurité sans affecter le rendement final. Centrifuger le précipité à 0 °C pendant 20 min à 9000 x g et jeter le supernatant. Laver le produit une fois avec de l’éthanol glacé à 70 % et une centrifugeuse pendant 15 min à 13 000 x g. Retirer le supernatant et sécher le granulé pendant 5 à 15 min. Resuspendez le granulé dans jusqu’à 40 μL d’eau sans nucléase (ce volume peut être ajusté en fonction de la taille des granulés isolés) et évaluez le rendement et la pureté spectrophotométriquement, comme décrit dans 2.1.4. Conserver le dsRNA purifié à -20 °C jusqu’à ce qu’il soit utilisé davantage. Utilisez le dsRNA purifié pour l’injection au stade de développement souhaité. 3. Collecte et préparation d’embryons T. marmoratus à un stade précoce pour les injections dsRNA Préparer une plaque d’agarose pour l’incubation des embryons de T. marmoratus. Tout d’abord, dissoudre 20 mg de poudre d’agarose à faible fusion dans 100 mL d’eau distillée autoclavée (2% d’agarose) puis faire bouillir ce mélange au micro-ondes jusqu’à ce qu’une solution claire soit obtenue. Prenez soin de la solution chaude, car les bulles d’air peuvent provoquer son débordement. Distribuer cette solution dans un petit plat Petri. Pour faire des rainures (qui tiendront les embryons) à la surface de la plaque d’agarose, placez trois tubes en plastique de 1 à 2 mm de large (tels que les pointes des pipettes de transfert en plastique) sur la surface de l’agarose liquide avant qu’elle ne se solidifie. Une fois que l’agarose se solidifie, utilisez une paire de forceps émoussés pour enlever ces tubes. Ajouter 500 μL d’eau distillée autoclavée à l’aide d’une micropiplette P1000 pour couvrir ces indentations dans l’agarose. À l’aide d’un pinceau naturel fin pour les cheveux, recueillir des embryons de T. marmoratus qui ont entre 5 et 8 h à partir des sites de nidification du coléoptère dans un plat de cavité en verre rempli d’eau distillée autoclavée. Surveillez fréquemment les sites de nidification pour vous assurer que les œufs obtenus sont de l’âge approprié. Déchorioniser les embryons sous un stéréomicroscope à l’aide de forceps fins de dissection. Pour ce faire, visualisez le chorion au microscope (au grossissement souhaité) en positionnant la source lumineuse à un angle approprié, puis prenez le chorion de deux côtés avec des forceps pointus, déchirez-le et faites glisser doucement l’embryon. Comme il ya deux couches, assurez-vous que les deux sont enlevés. À l’aide d’un pinceau naturel fin, transférer soigneusement les embryons du plat de cavité en verre à la plaque d’agarose et les disposer dans les rainures sous un stéréomicroscope. Prenez grand soin pendant ce processus, car les embryons déchoirés sont très fragiles. Utilisez les embryons préparés pour les injections dsRNA.REMARQUE : L’extrémité légèrement plus épaisse est le côté de l’embryon dans lequel la tête se développera. 4. microinjections dsRNA dans les embryons de T. marmoratus au stade précoce Pour injecter des embryons à un stade précoce avec un dsRNA spécifique aux gènes, préparez des aiguilles de microinjection à l’aide d’un pulleur d’aiguille à microinjection (voir tableau des matériaux). Tout en visualisant la pointe de l’aiguille sous un stéréomicroscope, utilisez une paire de forceps fins pour briser la pointe de l’aiguille, créant un bord pointu. Idéalement, casser la pointe de l’aiguille en diagonale de sorte qu’un bord plus pointu reste d’un côté, ce qui lui permettra d’entrer dans l’embryon tout en causant des blessures minimales. Décongeler la solution dsRNA de stock purifié sur la glace, ajouter 1 μL du tampon d’injection 10x et le compléter avec de l’eau distillée double, pour faire 10 μL de solution d’injection. Pour les injections, une concentration d’ARN de 1 μg/μL est habituellement appropriée, mais peut être ajustée en fonction de la gravité phénotypique des animaux qui en résultent).REMARQUE : Préparer 1 mL de tampon d’injection 10×22 en ajoutant 10 μL de tampon de phosphate de sodium de 0,1 M (fait en mélangeant 8,5 mL de 1 M Na2HPO4 et 1,5 mL de 1 M NaH2PO4 ajusté à un pH 7,6 à 25 °C avec 100 μL de 0,5 M KCl), 100 μL de colorant alimentaire et 790 μL d’eau double distillée. À l’aide d’une pipette P10, remplissez l’aiguille de microinjection avec la solution dsRNA de travail. Une fois que la solution a rempli la pointe de l’aiguille, attachez-la à un support de microaèdille relié à un système de microinjection qui utilise la technologie d’éjection de pression (voir tableau des matériaux). Allumez le système de microinjection et l’alimentation en air pressurisé. En utilisant le microvalve sur le système de microinjection, ajuster la pression d’injection à 15 psi. Réglez la durée d’injection à l’aide du bouton d’ajustement de temps (définissez-le sur « Secondes »). Comme la durée d’injection dépend du volume d’injection requis, si nécessaire, ajuster ce paramètre sur le système de microinjection avant chaque injection. Utiliser un volume d’injection de 1 à 2 nL pour les embryons T. marmoratus à un stade précoce.REMARQUE : Des volumes d’injection plus élevés ont tendance à interférer avec le taux de survie des embryons. Pour mesurer le volume de liquide d’injection qui est distribué par le système de microinjection, calibrer l’aiguille d’injection en évaluant le volume de la bulle de fluide qui se forme à l’extrémité de l’aiguille lors de l’injection dans l’air. Pour les embryons de T. marmoratus, utilisez une taille optimale de bulle de 100–200 μm. L’aiguille d’injection est de bonne qualité si cela peut être réalisé à 15 psi avec une durée d’injection de ~3 s. Aligner l’aiguille et la plaque d’agarose contenant les embryons sous un stéréomicroscope, de sorte que l’aiguille s’approche des embryons à un angle compris entre 45° et 60°. À l’aide du micromanipulateur, déplacez le microdécement lentement tout en surveillant les progrès à travers le stéréomicroscope. Une fois que la pointe de l’aiguille touche la surface d’un embryon, déplacez soigneusement l’aiguille vers l’avant jusqu’à ce qu’elle perce la surface de l’embryon. Ne perforez pas l’embryon profondément avec la pointe de l’aiguille, car cela peut affecter la survie de l’embryon. Pour réduire la variabilité, livrer l’injection au milieu de l’embryon. Une fois que l’aiguille est à l’intérieur de l’embryon, appuyez soigneusement sur le bouton d’injection du micro-injecteur pour délivrer la dose d’ARN à l’embryon. Après avoir injecté 1–2 nL de dsRNA, rétractez lentement l’aiguille de l’embryon, de sorte qu’elle ne provoque pas la rupture de l’embryon. Injectez les autres embryons de la même façon. Si l’aiguille de microinjection est bloquée pendant la procédure, débloquez-la en augmentant la pression et la durée de l’injection. Identifier visuellement les embryons injectés avec succès par la présence d’une tache colorée sur le site de l’injection (puisque le tampon d’injection contient des colorants alimentaires). Placez soigneusement le plat avec des embryons injectés dans une chambre d’humidité. Pour construire une telle chambre, prendre n’importe quelle boîte en plastique avec un couvercle, la stériliser avec 70% d’éthanol, lui permettre de sécher, et placer le tissu trempé dans l’eau autoclavée au fond pour fournir un environnement humide. Placez cette chambre d’humidité dans un incubateur à température appropriée (dans ce cas, 25 °C) et un cycle de lumière de 14 h de lumière et 10 h de noir. Laisser les embryons injectés se développer en premières larves d’étoiles, ce qui nécessite 4 à 5 jours. Surveiller les progrès du développement de l’embryon quotidiennement à l’aide d’un stéréomicroscope pour identifier les phénotypes morphologiquement visibles knockdown comme décrit à la figure 2. Documentez ces progrès en prenant des images numériques à l’aide d’une caméra haute résolution. Enlever les embryons morts et reconstituer l’eau de la plaque d’agarose chaque jour pour éviter la dessiccation et la propagation possible de la contamination microbienne à d’autres embryons survivants pendant la période d’incubation. Effectuer des contrôles appropriés pour les injections de dsRNA, y compris les injections tampon, les injections de dsRNA synthétisées contre le brin de sens du gène d’intérêt, et les injections de dsRNA synthétisé contre des séquences qui n’existent pas dans l’organisme cible. Confirmer RNAi knockdown en utilisant des méthodes moléculaires supplémentaires22. 5. Préparation des larves de T. marmoratus pour les injections de dsRNA REMARQUE : Contrairement aux embryons à un stade précoce, les larves de T. marmoratus sont relativement robustes et peuvent être injectées avec de plus grands volumes. Par exemple, les deuxièmes instars peuvent être injectées avec jusqu’à 2 μL de solution de travail dsRNA et troisième instars avec au moins 3 μL sans effets négatifs notables sur le taux de survie. Pour injecter de l’ARN, il est utile d’immobiliser les larves en les intégrant dans l’agarose. Avant de recueillir les larves, faire fondre 2 % d’agarose et la garder dans un bain d’eau à 60–70 °C pour la maintenir sous forme liquide. Préparer un plat d’immobilisation en versant de l’agarose fondue de 2 % dans une petite boîte de Pétri, puis en refroidissant jusqu’à ce qu’elle soit solidifiée. Utilisez des forceps émoussés pour faire une rainure peu profonde dans la plaque d’agarose (à peu près la taille de l’arthropode à intégrer) pour chaque animal qui sera injecté. Recueillir les jeunes larves au stade de développement approprié (un stade avant le stade souhaité pour analyse). Pour ce faire, égouttez soigneusement l’eau des gobelets de culture contenant les larves et suivez les étapes mentionnées ci-dessous. Anesthésier sur la glace (ramasser soigneusement la larve de sa tasse d’eau et la placer doucement sur la glace) jusqu’à ce que la larve ne montre aucun mouvement notable. Utilisez des forceps émoussés et mous pour soulever soigneusement la larve de la glace et la placer sur le stade d’immobilisation avec son cou et son corps dans la rainure, mais sa queue située au-dessus de la surface agarose afin qu’elle ne soit pas couverte, ce qui permet à la larve de continuer à respirer à travers ses spiracles de queue. Couvrir la larve d’une épaisse couche d’agarose qui est encore liquide mais pas dangereusement chaude. S’il a été accidentellement couvert, utilisez les forceps pour libérer la queue et les deux segments en dessous de l’agarose. Une fois que l’agarose se solidifie, utilisez la larve pour les injections de dsRNA. 6. microinjections dsRNA chez les larves de T. marmoratus Préparer et remplir une aiguille de microinjection avec la quantité désirée de solution de travail dsRNA spécifique au gène (comme décrit aux étapes 4.1–4.2). Attachez l’aiguille à un porte-aiguille relié à une seringue de microinjection contrôlée manuellement. Avant de fixer l’aiguille, tirez le piston de seringue tout le chemin pour éviter de manquer de pression d’injection à mi-procédure. Positionner la larve immobilisée de telle sorte que le site d’injection, qui se trouve dossalement entre les segments de la troisième et de la quatrième plaque corporelle, soit aligné sur la trajectoire de l’aiguille de microinjection à un angle relativement plat (presque parallèle à l’étape).REMARQUE : La pêche à l’aiguille et la larve dans cette position est importante, car elle fournit le chemin de la moindre résistance pour que la pointe de l’aiguille perfore les larves avec des dommages minimaux. Une fois que l’aiguille et la larve ont été positionnées, déplacez soigneusement la pointe de l’aiguille dans la larve à l’aide du micromanipulateur tout en surveillant la progression à travers un stéréomicroscope. Après que la pointe perfore le tissu, appliquez lentement et soigneusement la pression sur la seringue. Ajuster la pression d’injection en observant le mouvement du liquide d’injection coloré dans l’aiguille sous le microscope. Rétractez soigneusement l’aiguille après l’injection. Utilisez des forceps mous pour décoller et donc libérer la larve de l’agarose. Transférer la larve dans un récipient avec de l’eau (à température ambiante) et lui permettre de se développer davantage dans un incubateur ou une salle de culture à 25\u201228 °C et un cycle léger de 14 h de lumière et 10 h de noir. Utiliser des injections de contrôle appropriées et des quantifications de knockdown, comme indiqué à l’étape 4.10.