特定の発生時における遺伝子発現を操作するための強力なツールとしての水生カブトムシのRNA干渉

1. RNAの単離およびデノボのトランスクリプトームアセンブリ 脂質が豊富な組織用に設計されたRNA分離キット( 材料表を参照)を使用して、第3段階の第3段階の潜水カブトムバル眼管および成虫カブトムシから完全なRNA分離を行います。 T. marmoratus から全RNAを分離し、前に説明した方法18に従って配列する。 デノボトランスクリプトームアセンブリ注:トランスクリプトーム・デ・ノボを組み立てるには、様々なバイオインフォマティクスプラットフォームを使用できます( 資料表を参照)。これらのプラットフォームは市販されており、場合によっては Unix ベースのコマンドラインスクリプトとして存在します。アセンブリは de novo であるため、2 つのプラットフォームで独立してトランスクリプトームを組み立て、結果を比較して偽陽性または偽陰性を除外することをお勧めします。 トランスクリプトームの組み立てを開始するには、それぞれのバイオインフォマティクスプラットフォームで生読み取りをアップロードします。注:これらのファイルは、通常、圧縮され、FASTQSANGERの形式で行われます。Gz。この形式は次のステップで受け入れられるので、ファイルを解凍する必要はありません。 Trimmomatic コマンド ラインを使用して、生の読み取りをトリムして、既定のしきい値を下回るアダプター シーケンスまたは短い読み取りを削除します。トリミングされた生の読み取りを解凍します。ファイルは FASTQ 形式になります。各サンプルの FASTQ の生読み取りを連結して、de novo アセンブリの準備ができているファイルを取得します。 トランスクリプトーム・デ・ノボを組み立てることができるコマンドラインスクリプトを使用して、連結された生の読み取りを組み立てます。組み立てられたトランスクリプトームを保存しますが、それぞれのシーケンスを持つコンティグのリストが FASTA ファイルとして作成されます。アセンブリのカバレッジを増やすには、同じ種の複数のトランスクリプトームを組み合わせて組み立てます。注: このプロセスは、より正確なコンティグを生成する可能性を高め、低コピー数の遺伝子が関心がある場合に特に重要です。 組み立てたら、カバレッジスコアを計算してトランスクリプトームの完全性を評価します(カバレッジ評価ソフトウェアは自由に利用できます、 資料表を参照)。注: カバレッジ スコアが 75% のトランスクリプトームは良好と見なされます。しかし、このスコアの関連性は、トランスクリプトーム生成の理由に依存する。たとえば、トランスクリプトームが低コピー数の遺伝子を識別するために使用されている場合、より大きなカバレッジを意味するので、スコア>85%が優れています。 基本的なローカルアライメント検索ツールを使用して、デノボアセンブルトランスクリプトームにアノセンティブを付けます (BLAST; 資料一覧を参照)。注:この実験では、トランスクリプトームは、主に既知の ショウジョウバエ タンパク質のデータベースと既知のカブトムシタンパク質のデータベースに対して注釈を付けました。注釈のリストは、スプレッドシートファイルとしてダウンロードすることができ、他の生物のタンパク質とのシーケンスの類似性を示すコンティグ/コンティグは、FASTAファイルとしてダウンロードすることができます。 目的のタンパク質のコンティグ数/数を特定し、ヌクレオチド配列を抽出します。BLASTを使用して、タンパク質特異的保存領域(ホメオボックスドメインなど)が、対象のアノケン化されたヌクレオチド配列に存在しているかどうかを特定します。ヌクレオチド配列の重複について同じアノテーションを持つ他のコンティグをチェックして、遺伝子特異的転写物の配列を生成します。注:シーケンスの重複を持つコンティグを特定することは、通常、すべての遺伝子、特に低コピー数遺伝子では不可能です。 遺伝子の全長配列が必要な場合は、cDNA末端の3′および5′急速増幅などの技術を用いて成熟した転写物全体の塩基配列を同定するための開始点として最も高い配列類似性を有するコンティグから始める(RACE19)。 手順 1.2.4 – 1.2.7 に従って、2 番目のプラットフォームから取得したアセンブリにアセトします。注: 理想的には、結果は、目的のタンパク質に類似している必要があります。ただし、カバレッジはプラットフォームによってある程度異なる場合があります。 組み立てたトランスクリプトームを使用して、セクション2で概説されているように種特異的dsRNAを合成する。 2. クローニングと遺伝子特異的dsRNA合成 注: 遺伝子特異的クローニングおよびdsRNA合成は、T.カスタネウム20、21、2221,22について詳細に説明されています。20以下の手順は、簡単な概要です。 クローニング、細菌変換、プラスミドシーケンシング 全RNAを生物から分離し(ステップ1.1で説明)、逆転写キットを使用して相補的DNA(cDNA)を作成する( 材料表を参照)。対象の遺伝子に特異的なコンティグから1つまたは2つの100〜1000 bpのヌクレオチド配列を同定します。 同定されたヌクレオチドのストレッチ全体にまたがるプライマーペアを設計し、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を介して配列を増幅します。最後に30分のステップを追加して、増幅されたDNA製品に3′アデニンオーバーハングを作成します。PCR精製キットを使用してこの製品を精製します( 材料表を参照)。 クローニングキットに付属するベンダーのプロトコルに従って、精製した製品をpCR4-TOPOプラスミドベクター( 資料表を参照)にクローン化します。熱ショック処理を使用すると、クローン化されたプラスミドを有能な細菌細胞(株: 大腸菌 DH10B)に変換し、有能な細胞のベンダーのプロトコル( 材料表を参照)、正常に変換された細胞をスクリーニングします。注:コロニーを持つプレートは、水分を保持するためにパラフィンフィルムに包み、最大1ヶ月間4°Cで保存することができます。 37°Cのシェーカーインキュベーターでアンピシリン(50μg/mL)を含むリソジニーブロス(LB)で10μLピペットチップと培養を使用して形質転換細胞のコロニーを摘み取り、24時間で200rpmを培養します。注:長期保存のために、培養細胞は100%グリセロールで1:1希釈し、グリセロールストックとして-80°Cで凍結することができます。 ミニプレップ分離キットを使用して、この培養物から目的の遺伝子を含むプラスミドを分離します (材料表を参照)。分光光度を評価した後、-20°Cで分離プラスミド(minipreps)を保管します。具体的には、260 nm、280 nmおよび230nmでのサンプル吸光度を測定する。DNAを定量する比率A 260/A280、DNA純度を定量するA260/A230を計算します。260280 230注:260/280比1.8は一般に十分に純粋なDNAとして受け入れられ、1.5より低い比率はフェノールなどの残留抽出試薬の存在を示す。260/230 の比率は 260/280 の比率以上である必要があります。低い比率は、残留試薬汚染を示します。収率は通常100から500 ng/μLの範囲です。 分離されたminiprepsを配列して、遺伝子特異的断片が正常に統合され、プラスミド内の5′T7と3′T3プロモーター領域の間に横たわっていることを確認する。これは、ユニバーサルT7とT3シーケンシングプライマー22を使用して行うことができます。dsRNA調製物に関心のある遺伝子特異的配列を用いてミニプレップを使用してください。 PCR増幅とインビトロdsRNA合成 PCR増幅と製品精製 5’側にT7プロモーター配列を持つプラスミド特異的または遺伝子特異的プライマーを設計し(詳細については参照22 を参照)、挿入された遺伝子の直線的な断片を増幅する。20 μLの反応を少なくとも10回設定して、収率を最適化します。注:結果として得られる製品は、2つの20 bp T7ポリメラーゼ結合部位によって横に並んでいます。 ベンダーのカラムベース溶出プロトコルに従って、PCR製品精製キット( 材料表を参照)を使用してPCR製品を精製します。収率を上げるには、最終溶出ステップを同じ溶出で3回まで繰り返します。分光光度の収率を評価する。注:収率は通常100から700 ng /μLの範囲です。この精製物は、さらに使用されるまで-20°Cで保存することができる。 インビトロdsRNAの合成と精製 遺伝子特異的PCR精製産物を使用して、選択したdsRNA合成キットのプロトコルに従ってインビトロでdsRNAを合成します。必要に応じて、dsRNA産生を増加するためのインキュベーション時間を延長する。 反応混合物の不透明度に基づいて反応の進行を評価する(dsRNA生成物の量が多いほど、濁度が高くなる)。インキュベーションの終了時に、DNase処理を用いて反応を停止する。これを行うには、2 U / μLのストックから1μLを加え、反応混合物に加えます。この処理を1~2時間まで延長し、テンプレートDNAの最適な分解を確実にします。 精製キットまたは以下の手順でdsRNAを精製します。 得られた製品をヌクレアーゼを含まない水を115μLで希釈し、3M酢酸ナトリウムの15μLを加えます。この反応混合物に2量の氷冷100%エタノールを加え、-20°Cで一晩dsRNAを沈殿させる。注: この時点で、サンプルは最終歩留めに影響を与えることなく安全に保存できます。 9000 x g で0°Cで沈殿を20分間遠心し、上清を捨てます。氷冷70%エタノールと遠心分離機で1回13000xgで15分間洗浄 してください。 上清を取り除き、ペレットを5〜15分間乾燥させ、最大40μLのヌクレアーゼフリー水でペレットを再懸濁し(この体積は単離ペレットサイズに基づいて調整可能)、2.1.4に記載されているように分光光度と収率を評価します。 精製したdsRNAを-20°Cで保管し、さらに使用するまで保管してください。精製されたdsRNAを使用して、所望の現像段階で注射を行います。 3. dsRNA注射用初期T. マルモラトゥス 胚の収集と調製 T.マルモラトゥス胚のインキュベーションのためにアガロースプレートを準備します。 まず、100mLのオートクレーブ蒸留水(2%アガロース)に低融解アガロース粉末20mgを溶解し、次いで透明な溶液が得られるまで電子レンジで沸騰させます。気泡が溢れる可能性がありますので、熱い溶液に注意してください。 この溶液を小さなペトリ皿に分配します。アガロースプレートの表面に溝(胚を保持する)を作るためには、液体アガロースの表面に3つの1〜2mm幅のプラスチックチューブ(プラスチック転写ピペットの先端など)を固める前に置きます。 アガロースが固まったら、これらのチューブを取り除くために鈍い鉗子のペアを使用してください。P1000マイクロピペットを使用して500μLのオートクレーブ蒸留水を加え、アガロースのこれらのインデントをカバーします。 細かい天然毛の絵筆を使って、オートクレーブ蒸留水で満たされたガラスの空洞皿のカブトムシの巣から5〜8時間の古い T.マルモラトゥ ス胚を集めます。入れ子サイトを頻繁に監視して、得られた卵が適切な年齢であることを確認します。 微細解剖鉗子を用いて、実体顕微鏡下で胚をデコリオネートする。そのためには、光源を適切な角度に配置して顕微鏡下で(所望の倍率で)絨毛を視覚化し、鋭い鉗子で両側から絨毛を掴み、開き、そして、胚をそっと引き出します。2 つのレイヤーがあるので、両方とも削除されていることを確認します。 細かい天然毛のペイントブラシを使用して、慎重にガラスキャビティ皿からアガロースプレートに胚を転送し、実体顕微鏡の下で溝にそれらを配置します。デコリオネート胚は非常に壊れやすいので、このプロセス中に細心の注意を払ってください。dsRNA注射のために準備された胚を使用してください。注:少し厚い端は、頭部が発達する胚の側面です。 4. 初期 T.marmoratus 胚におけるdsRNAマイクロインジェクション 初期段階の胚に遺伝子特異的なdsRNAを注入するには、マイクロインジェクションニードルプーラーを使用してマイクロインジェクションニードルを準備します( 材料表を参照)。実体顕微鏡で針先を視覚化しながら、細かい鉗子を使って針先を壊し、鋭いエッジを作り出します。理想的には、針先を斜めに破って、より鋭いエッジが片側に残り、最小限の損傷を引き起こしながら胚に入ることができるようにします。 精製されたストックdsRNA溶液を氷の上に解凍し、10x注入バッファーの1μLを加え、二重蒸留水で上に置き、10 μLの注入溶液を作ります。注射の場合、dsRNA濃度は通常1μg/μLに適していますが、得られた動物の表向きの重症度に応じて調整することができます)。注:0.1 Mリン酸ナトリウムバッファーの10 μLを加えて10x注入バッファー22 の1mLを準備します(1 M Na2HPO4の8.5 mLと1.5 mLの1 M Naの混合によって作られました H2PO4は、100 μL 0.5 M KCl、100 μLの食品染料、790 μLの二重蒸留水で、25°CでpH 7.6に調整しました。 P10ピペットを使用して、マイクロインジェクションニードルに働くdsRNA溶液をバックフィルします。溶液が針の先端を満たしたら、圧力放出技術を利用するマイクロインジェクションシステムに接続されたマイクロニードルホルダーに取り付けます( 材料表を参照)。 マイクロインジェクションシステムと加圧空気供給をオンにします。マイクロインジェクションシステムのマイクロバルブを使用して、射出圧力を15 psiに調整します。時間調整ノブを使用して射出時間を調整します(“秒”に設定)。 射出時間は必要な注入量に依存するので、必要に応じて、各注入の前にマイクロインジェクションシステムでこのパラメータを調整します。初期の T. marmoratus 胚に対して 1 – 2 nL の射出体積を使用します。注:より高い注入量は、胚生存率を妨げる傾向があります。 マイクロインジェクションシステムによって分配される注入液の体積を測定するために、空気中に注入するとき針の先端に形成される液体の気泡の容積を査定することによって注入針を較正する。 T.marmoratus 胚の場合は、最適なバブルサイズ100~200μmを使用してください。注射針は、〜3 sの注射時間で15 psiで達成できる場合は良質である。 針が45°と60°の間の角度で胚に近づくような、実体顕微鏡下で胚を含む針とアガロースプレートを合わせます。 マイクロマニピュレーターを使用して、顕微鏡を通して進捗を監視しながらマイクロニードルをゆっくりと動かします。針の先端が胚の表面に触れたら、慎重に針を前に動かし、胚の表面に突き刺さる。これは胚の生存に影響を与える可能性があるため、針先で胚を深く穿穿しないでください。変動を減らすために、胚の真ん中に注射を送出する。 針が胚の中に入ったら、マイクロインジェクターの注射ボタンを慎重に押して、dsRNAの用量を胚に送達する。1-2 nLのdsRNAを注入した後、ゆっくりと胚から針を引き込み、胚が破裂しないようにする。 同様の方法で他の胚を注入します。処置中にマイクロインジェクション針がブロックされた場合は、注射圧と持続時間を増やしてブロックを解除します。注射部位に着色スポットが存在することにより、正常に注入された胚を視覚的に識別する(注射バッファーには食品着色が含まれているため)。 慎重に注入された胚で皿を湿度室に置きます。 このようなチャンバーを構築するには、蓋付きのプラスチック製の箱を取り、70%エタノールで殺菌し、乾燥させ、下部のオートクレーブ水に浸した組織を置いて湿った環境を提供します。適切な温度(この場合は25°C)と14時間光と10時間暗の光サイクルで、この湿度チャンバーをインキュベーターに入れます。 注射された胚が最初のインスター幼虫に発達することを可能にし、4〜5日を要する。 図2に示すように、組織学的に目に見えるノックダウン表現型を同定するために、実体顕微鏡を用いて、胚発生の進捗状況を毎日監視する。 高解像度カメラを使用してデジタル画像を撮影して、この進行状況を文書化します。死んだ胚を取り除き、毎日アガロースプレートの水を補充して、潜水期間中に他の生き残った胚への乾燥および微生物汚染の可能性を避けます。 dsRNA注射に対して適切な制御を行い、バッファー注射、目的の遺伝子のセンス鎖に対して合成されたdsRNAの注射、および標的生物内に存在しない配列に対して合成されたdsRNAの注射を行う。追加の分子法22を用いてRNAiノックダウンを確認する。 5. dsRNA注射用 のT.マルモラス 幼虫の調製 注:初期の胚とは異なり 、T.マルモラス 幼虫は比較的頑丈であり、より大きな体積で注入することができます。例えば、第2のインスターは、生存率に顕著なマイナスの影響を及ぼすことなく、最大2μLのdsRNA作業溶液および3μL以上の3番目のインスターを注入することができる。dsRNAを注入するには、幼虫をアガロースに埋め込むことで幼虫を固定化することが有用である。 幼虫を採取する前に、2%アガロースを溶かし、60~70°Cの水浴に入れ、液体状に保ちます。溶かした2%のアガロースを小さなペトリ皿に注ぎ、固まるまで冷却して固定化皿を準備します。注射される動物ごとに、アガロースプレート(埋め込まれる節足動物の大きさ)に浅い溝を作るために鈍い鉗子を使用してください。 適切な発達段階(分析に必要な段階の1段階前)に若い幼虫を集める。これを行うには、幼虫を含む培養カップから慎重に水を排出し、以下の手順に従ってください。 幼虫が顕著な動きを見せないように氷の上で麻酔(慎重に水カップから幼虫を取り出し、氷の上にそっと置く)鈍い柔らかい鉗子を使用して、慎重に氷から幼虫を持ち上げ、首と体を溝に入れた固定化段階に置きますが、その尾はアガロース表面の上に位置し、幼虫が尾のスパイクルを通して呼吸を続けることができるようにします。 まだ液体であるが、危険なほど熱くないアガロースの厚い層で幼虫を覆います。誤って覆われた場合は、鉗子を使用して尾部と、その下の2つのセグメントをアガロースから解放します。アガロースが固まったら、dsRNA注射に幼虫を使用する。 6. Marmoratus幼虫におけるdsRNAマイクロインジェクション マイクロインジェクションニードルに遺伝子特異的dsRNA作業溶液の所望量を準備し、バックフィルします(ステップ4.1~4.2で説明します)。手動で制御されたマイクロインジェクション注射器に接続された針ホルダーに針を取り付けます。針を取り付ける前に、注射器プランジャーをずっと引っ張って、注入圧力の中途半端な手順を使い果たさないようにします。 固定化された幼虫を固定化した幼虫の位置は、第3および第4のボディプレートセグメントの間に後ろ方向に位置する注射部位が、比較的平坦な角度(ステージとほぼ平行)でマイクロインジェクション針の軌跡と一致するようにする。注:針と幼虫をこの位置に釣り合うことは、針先が幼虫を最小の損傷で穿孔するための最小抵抗の経路を提供するので重要です。 針と幼虫を配置したら、顕微鏡で進捗をモニタリングしながら、マイクロマニピュレーターを使用して針先を幼虫に入れ込みます。 先端が組織を穿穿した後、ゆっくりと慎重に注射器に圧力をかける。顕微鏡下で針の着色注入液の動きを観察して射出圧力を調整します。 注射後は慎重に針を引っ込みます。柔らかい鉗子を使って剥がし、幼虫をアガロースから解放する。幼虫を水(室温)の容器に戻し、25\u201228°Cの培養器または培養室でさらに発達し、14時間光と10時間の暗さの光サイクルを可能にします。 ステップ 4.10 で概説されているように、適切な制御注入とノックダウン定量を使用します。