Belirli Gelişimsel Zaman Noktalarında Gen İfadesi Manipüle Etmek Için Güçlü Bir Araç Olarak Su Böcekleri RNA Girişim

1. RNA izolasyon ve de novo transkripsiyon montajı Lipit açısından zengin doku larvası için tasarlanmış bir RNA izolasyon kiti (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanarak geç evre üçüncü instar dalış böceği larva göz tüplerinden ve yetişkin böceklerden toplam RNA izolasyonu gerçekleştirin. Toplam RNA’yı T. marmoratus’tan ayırın ve daha önce açıklanan yöntemleri takip ederek dizileyin18. De novo transkriptome montajNOT: Transkripsiyon de novo’yu monte etmek için çeşitli biyoinformatik platformları kullanılabilir (bkz. Malzeme Tablosu). Bu platformlar ticari olarak kullanılabilir ve bazı durumlarda Unix tabanlı komut satırı komut dosyaları olarak mevcuttur. Montaj de novo olduğundan, transkriptomların iki platformda bağımsız olarak bir araya getirilen ve yanlış pozitif veya yanlış negatifleri dışlamak için sonuçları karşılaştırmak önerilir. Transkriptomeleri bir araya getirmek için, ham okumaları ilgili biyoinformatik platformuna yükleyin.NOT: Bu dosyalar genellikle sıkıştırılmış ve format FASTQSANGER. Gz. Bu biçim bir sonraki adımda kabul edildiğiiçin dosyaları sıkıştırmaya gerek yoktur. Trimmomatic komut satırını kullanarak, bağdaştırıcı dizilerini veya varsayılan eşiğin altına düşen kısa okumaları kaldırmak için ham okumaları kırpın. Kesilmiş ham okur decompress; dosyalar artık FASTQ biçiminde olacaktır. De novo derlemesi için hazır dosyaları elde etmek için her örnek için FASTQ ham okumaları concatenate. Biraraya konabilir ham okuma de novo transcriptomes de novo monte edebilirsiniz herhangi bir komut satırı komut dosyası kullanarak. Şimdi bir FASTA dosyası olarak, kendi dizileri ile bitişik bir listesini olacak monte transkriptome kaydedin. Montaj kapsamını artırmak için, birleştirmek ve aynı tür için birden fazla transkriptomes monte.NOT: Bu işlem daha doğru kontig üretme şansını artırır ve düşük kopya sayısı genleri ilgi varsa özellikle önemlidir. Bir kez monte edildikten sonra, kapsama puanları hesaplayarak tamlığı için transkriptom değerlendirmek (kapsama değerlendirme yazılımı serbestçe kullanılabilir, Malzeme Tablosubakınız).NOT: Kapsama puanı > olan bir transkripsiyon iyi kabul edilir. Ancak, bu skorun alaka transkriptom nesil nedenine bağlıdır. Örneğin, transkripsiyon düşük kopya numarası genlerini tanımlamak için kullanılıyorsa, daha fazla kapsama alanı anlamına gelen bir skor > daha iyidir. Temel bir yerel hizalama arama aracı kullanarak de novo monte edilmiş transkripsiyonu açıklama (BLAST; bkz. Malzeme Tablosu).NOT: Bu deney için, transkripsiyon öncelikle bilinen Drosophila proteinlerinin bir veritabanı ve bilinen böcek proteinlerinin bir veritabanı karşı açıklamalı oldu. Ek açıklamalar listesi elektronik tablo dosyası olarak indirilebilir ve diğer organizmaların proteinlerine sıra benzerliğini gösteren bitişik/bitişik ler FASTA dosyası olarak indirilebilir. İlgi proteininin bitişik sayısını/sayısını belirleyin ve nükleotit dizilerini ayıklayın. Proteine özgü korunmuş bölgelerin (homeobox etki alanları gibi) açıklamalı nükleotit dizisinde bulununp bulunmadığını belirlemek için BLAST’ı kullanın. Genlere özgü bir transkriptin dizisini oluşturmak için nükleotit dizisi çakışmaları için aynı ek açıklamaya sahip diğer bitişikleri kontrol edin.NOT: Dizi çakışması ile bitişik belirlenmesi genellikle tüm genler için, özellikle düşük kopya numarası genler için mümkün değildir. Genin tam uzunlukta dizigerekli ise, cDNA biter 3 ‘ ve 5′ hızlı amplifikasyon gibi teknikleri kullanarak tüm olgun transkript nükleotit dizisini tanımlamak için bir başlangıç noktası olarak en yüksek sırabenzerliğe sahip kontig ile başlayın (RACE19). 1.2.4-1.2.7 adımlarını izleyen ikinci platformdan alınan derlemeye açıklama ekin.NOT: İdeal olarak, sonuçlar ilgi proteinler için benzer olmalıdır; ancak, kapsama bir dereceye kadar platformlar arasında farklı olabilir. Bölüm 2’de belirtildiği gibi türlere özgü dsRNA sentezlemek için birleştirilmiş transkripsiyonu kullanın. 2. Klonlama ve gen özel dsRNA sentezi NOT: Gen-spesifik klonlama ve dsRNA sentezi Ayrıntılı olarak T. castaneum20,21,22için açıklanmıştır. Aşağıdaki adımlar kısa bir genel bakış vardır. Klonlama, bakteriyel dönüşüm ve plazmid dizilimi Toplam RNA’yı organizmadan izole edin (adım 1.1’de açıklandığı gibi) ve ters transkripsiyon kiti kullanarak tamamlayıcı DNA (cDNA) oluşturun (bkz. Malzemeler Tablosu). İlgi genlerine özgü olan bir veya iki 100-1000 bp nükleotit dizisini bitişiklerden tanımlayın. Tanımlanan nükleotitlerin tüm streç kapsayan tasarım astar çiftleri ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile sırayı yükseltmek. Güçlendirilmiş DNA ürününde 3’ adenin çıkıntılar oluşturmak için sonunda ekstra bir 30 dakika adım ekleyin. Bu ürünü bir PCR arıtma kiti kullanarak arındırın (bkz. Malzeme Tablosu). Saflaştırılmış ürünü, klonlama kiti ile sağlanan satıcının protokolünden sonra pCR4-TOPO plazmid vektörü (bkz. Malzemeler Tablosu)halinde klonla. Isı şoku tedavisi kullanarak yetkili hücreler için satıcının protokolü aşağıdaki yetkili bakteri hücrelerine (suş: E.coli DH10B) klonlanmış plazmidler dönüştürmek (Malzemeler Tablosubakınız ), ve başarılı bir şekilde dönüştürülmüş hücreler için ekran.NOT: Kolonili plakalar, nemi korumak için parafin filmine sarılır ve 4 °C’de bir aya kadar saklanabilir. 37 °C’de bir çalkalama-kuluçka makinesinde ampisilin (50 μg/mL) içeren lysogeny suyu (LB) içinde 10 μL pipet ucu ve kültür kullanarak dönüştürülmüş hücrelerin kolonilerini seçin ve 24 saat boyunca 200 rpm’de.NOT: Uzun süreli depolama için kültürlü hücreler 1:10 gliserol ile seyreltilebilir ve -80 °C’de gliserol stokları olarak dondurulabilir. Miniprep izolasyon kiti kullanarak bu kültürden ilgi geni içeren plazmidleri izole edin (bkz. Malzemeler Tablosu). İzole plazmidleri (minipreps) verimi spektrofotometrik olarak değerlendirdikten sonra -20 °C’de saklayın. Özellikle, 260 nm, 280 nm ve 230 nm’de numune emiciliğini ölçün. DNA’yı ölçmek için A260/A280 ve DNA saflığını ölçmek için260/A230 oranlarını hesaplayın.NOT: 1.8 260/280 oranı genellikle yeterince saf DNA olarak kabul edilir, oranları 1.5 daha düşük fenol gibi artık ekstraksiyon reaktiflerin varlığını gösterir. 260/230 oranı 260/280 oranından daha büyük veya eşit olmalıdır. Daha düşük oranlar artık reaktif kontaminasyonunu gösterir. Verim genellikle 100 ila 500 ng/μL arasında değişir. Gene özgü parçanın başarılı bir şekilde entegre edildiğini doğrulamak için izole minipreps sıralayın, plazmid 5 ‘ T7 ve 3′ T3 promotör bölgeleri arasında çevrili olan; bu evrensel T7 ve T3 sıralamaastarları 22kullanılarak yapılabilir. DSRNA hazırlığı için genlere özgü ilgi sırası ile minipreps kullanın. PCR amplifikasyon ve in vitro dsRNA sentezi PCR amplifikasyon ve ürün arıtma Eklenen genin doğrusal bir parçasını yükseltmek için 5’ yanlarında T7 promotör dizisi bulunan plazorta özgü veya gen özgü astarlar tasarlayın (ayrıntılar için referans22’ye bakın). Her biri en az 20 μL’lik en az 10 reaksiyon oluşturarak verimi optimize edin.NOT: Elde edilen ürün iki 20 bp T7 polimeraz bağlama siteleri ile çevrilidir. PCR ürününü, satıcının sütun tabanlı elüsasyon protokolünü izleyerek PCR ürün temizleme kiti (bkz. Malzemeler Tablosu)kullanarak arındırın. Verimi artırmak için, aynı eluent ile 3 kez kadar son elution adım tekrarlayın. Verimi spektrofotometrik olarak değerlendirin.NOT: Verim genellikle 100 ile 700 ng/μL arasında değişmektedir. Bu saflaştırılmış ürün daha fazla kullanım anına kadar -20 °C’de saklanabilir. In vitro dsRNA sentezi ve arınma Seçtiğiniz bir dsRNA sentez kiti protokolüne göre dsRNA in vitro sentezlemek için gen özel PCR saflaştırılmış ürün kullanın. Gerekirse, artan dsRNA üretimi için kuluçka süresini uzatın. Reaksiyon karışımının opaklığına göre reaksiyonun ilerlemesini değerlendirin (dsRNA ürününün miktarı ne kadar fazlaolursa, bulanıklık da o kadar yüksek olur). Kuluçka sonunda, bir DNase tedavisi kullanarak reaksiyonu durdurun. Bunu yapmak için reaksiyon karışımına 2 U/ μL’lik bir stoktan 1 μL ekleyin. Şablon DNA’nın optimum bozulmasını sağlamak için bu tedaviyi 1-2 saate kadar uzatın. DSRNA’yı bir arıtma kiti ile veya aşağıdaki adımlarla arındırın. Elde edilen ürünü 115°L nükleaz içermeyen su ile seyreltin ve 15 μL 3 M sodyum asetat ekleyin. Bu reaksiyon karışımına 2 cilt buz gibi 0 etanol ekleyin ve dsRNA’yı bir gecede -20 °C’de çökeltin.NOT: Bu noktada, numuneler nihai verimi etkilemeden güvenli bir şekilde saklanabilir. Çökeltiyi 9000 x g’da 20 dk için 0 °C’de santrifüj edin ve süpernatantı atın. 13000 x g 15 dakika boyunca buz gibi% 70 etanol ve santrifüj ile bir kez ürün yıkayın. 5-15 dakika boyunca pele’yi süpernatant ve hava kurutun. Pelet’i 40 μL’ye kadar nükleaz içermeyen suda yeniden askıya alın (bu hacim izole pelet boyutuna göre ayarlanabilir) ve 2.1.4’te açıklandığı gibi verim ve saflığı spektrofotometrik olarak değerlendirin. Saflaştırılmış dsRNA’yı daha fazla kullanım anına kadar -20 °C’de saklayın. İstenilen gelişim aşamasında enjeksiyon için saflaştırılmış dsRNA kullanın. 3. DsRNA enjeksiyonları için erken evre T. marmoratus embriyolarının toplanması ve hazırlanması T. marmoratus embriyolarının kuluçkaiçin bir agarose plakası hazırlayın. İlk olarak, otoklavdist distile su 100 mL düşük eriyen agarose tozu 20 mg çözün ve net bir çözüm elde edilene kadar bir mikrodalga bu karışımı kaynatın. Hava kabarcıkları taşma neden olabilir gibi sıcak çözelti ile dikkat edin. Küçük bir Petri kabına bu çözelti dağıtın. Agarose plakasının yüzeyine oluklar (embriyoları tutacak) yapmak için, katılaşmadan önce sıvı agarose’un yüzeyine üç adet 1-2 mm genişliğinde plastik boru (plastik transfer pipetleri gibi) yerleştirin. Bir kez agarose katılaşmak, bu tüpleri kaldırmak için künt forceps bir çift kullanın. Agarose’daki bu girintiyi kapsayacak şekilde P1000 mikropipet kullanarak 500 μL otoklavlı distile su ekleyin. Ince bir doğal saç boya fırçası kullanarak, otoklavlı distile su ile dolu bir cam kavite çanak böcek yuvalama sitelerinden 5-8 saat eski T. marmoratus embriyolar toplamak. Elde edilen yumurtaların uygun yaşta olduğundan emin olmak için yuvalama alanlarını sık sık izleyin. İnce diseksiyon forceps kullanarak bir stereomikroskop altında embriyolar dechorionate. Bunu yapmak için, uygun bir açıda ışık kaynağı konumlandırarak mikroskop altında chorion görselleştirmek (istenilen büyütme), sonra keskin çerkeler ile iki taraftan chorion kapmak, açık rip, ve yavaşça embriyo dışarı slayt. İki katman olduğundan, her ikisinin de kaldırıldığından emin olun. İnce bir doğal saç boya fırçası kullanarak, dikkatle agarose plaka için cam kavite çanak embriyolar transfer ve stereomikroskop altında oluklar onları düzenlemek. Dechorionated embriyolar çok kırılgan olduğu gibi, bu işlem sırasında büyük özen. DsRNA enjeksiyonları için hazırlanan embriyoları kullanın.NOT: Biraz daha kalın olan uç, embriyonun başın gelişeceği tarafıdır. 4. erken evre T. marmoratus embriyolarında dsRNA mikroenjeksiyonları Erken evre embriyolara genlere özgü dsRNA enjekte etmek için mikroenjeksiyon iğneleri mikroenjeksiyon iğnesi kullanarak hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu). İğne ucunu stereomikroskop altında görselleştirirken, iğne ucunu kırmak için bir çift ince çalgı kullanın ve keskin bir kenar yaratın. İdeal olarak, iğne ucunu çapraz olarak kırın, böylece daha keskin bir kenar bir tarafta kalır, bu da embriyoya girmesini sağlarken en az yaralanmaya neden olur. Buz üzerinde saflaştırılmış stok dsRNA çözeltisi çözülür, 10x enjeksiyon tampon 1 μL ekleyin ve çift distile su ile üst, enjeksiyon çözeltisi 10 μL yapmak için. Enjeksiyonlar için, 1 μg/μL dsRNA konsantrasyonu genellikle uygundur ancak ortaya çıkan hayvanların henotipik şiddetine göre ayarlanabilir).NOT: 1 mL 10x enjeksiyontamponu 22 0,1 M sodyum fosfat tamponu (1 M Na2HPO4 8.5 mL ve 1.5 mL 1 1 mL karıştırılarak yapılır 10 μL ekleyerek hazırlayın M NaH2PO4, 100 μL 0,5 M KCl, 100 μL gıda boyası ve 790 μL çift distile su ile 25 °C’de 7,6 pH’ya ayarlanır. P10 pipetkullanarak mikroenjeksiyon iğnesini çalışan dsRNA çözeltisi ile doldurun. Çözelti iğnenin ucunu doldurduktan sonra, basınç ejeksiyon teknolojisini kullanan bir mikroenjeksiyon sistemine bağlı bir mikroiğne tutucuya takın (bkz. Malzemeler Tablosu). Mikroenjeksiyon sistemini ve basınçlı hava kaynağını açın. Mikroenjeksiyon sistemindeki mikrovalfkullanarak enjeksiyon basıncını 15 psi’ye ayarlayın. Zaman ayarlama sıyrıklarını kullanarak enjeksiyon süresini ayarlayın (“Saniye” olarak ayarlayın). Enjeksiyon süresi gerekli enjeksiyon hacmine bağlı olduğu için, gerekirse bu parametreyi her enjeksiyondan önce mikroenjeksiyon sisteminde ayarlayın. Erken evre T. marmoratus embriyoları için 1-2 nL enjeksiyon hacmi kullanın.NOT: Yüksek enjeksiyon hacimleri embriyo sağkalım oranını etkileme eğilimindedir. Mikroenjeksiyon sistemi tarafından dağıtılan enjeksiyon sıvısının hacmini ölçmek için, havaya enjekte ederken iğnenin ucunda oluşan sıvı kabarcığının hacmini değerlendirerek enjeksiyon iğnesini kalibre edin. T. marmoratus embriyoları için 100-200 m optimum kabarcık boyutu kullanın. Enjeksiyon iğnesi, 15 psi’de ~3 s enjeksiyon süresi ile elde edilebiliyorsa kalitelidir. İğneyi ve embriyoları içeren agarose plakasını stereomikroskop altında hizalayın, öyle ki iğne embriyolara 45° ile 60° arasında bir açıyla yaklaştığında. Mikromanipülörü kullanarak, stereomikroskoptaki ilerlemeyi izlerken mikroiğneyi yavaşça hareket ettirin. İğnenin ucu bir embriyonun yüzeyine değdikten sonra, iğneyi embriyonun yüzeyini delip geçinceye kadar dikkatlice ileri doğru hareket ettirin. Bu embriyonun hayatta kalmasını etkileyebileceğinden, iğne ucuyla embriyoyu derinden delikletmeyin. Değişkenliği azaltmak için, embriyonun ortasında enjeksiyon teslim. İğne embriyonun içine girdikten sonra, mikro enjektörün enjeksiyon düğmesine dikkatlice basarak embriyoya dsRNA dozunu iletin. DSRNA’nın 1-2 nL’sini enjekte ettikten sonra, embriyonun kopmasına neden olmayacak şekilde iğneyi yavaş yavaş embriyodan geri çekin. Diğer embriyoları da benzer şekilde enjekte edin. İşlem sırasında mikroenjeksiyon iğnesi tıkanırsa, enjeksiyon basıncını ve süresini artırarak blokeyi kaldırın. Enjeksiyon yerinde renkli bir nokta nın varlığı yla başarılı bir şekilde enjekte edilen embriyoları görsel olarak tanımlayın (enjeksiyon tamponu gıda boyası içerdiğinden). Dikkatle bir nem odasında enjekte embriyolar ile çanak yerleştirin. Böyle bir oda inşa etmek için, bir kapak ile herhangi bir plastik kutu almak,% 70 etanol ile sterilize, kurumasını bekleyin, ve nemli bir ortam sağlamak için alt otoklavlı su batırılmış doku yerleştirin. Bu nem haznesini uygun bir sıcaklıkta (bu durumda 25 °C) ve 14 saat açık ve 10 saat karanlık ışık döngüsüne sahip bir kuvöze yerleştirin. Enjekte edilen embriyoların 4-5 gün gerektiren ilk instar larvalarına dönüşmesine izin verin. Şekil 2’debetimlendiği gibi morfolojik olarak görünür nakavt fenotipleri tanımlamak için bir stereomikroskop kullanarak embriyo gelişiminin ilerlemesini günlük olarak izleyin. Yüksek çözünürlüklü bir kamera kullanarak dijital görüntüler çekerek bu ilerlemeyi belgele. Ölü embriyoları çıkarın ve kuluçka döneminde mikrobiyal kontaminasyonun diğer embriyolara yayılmasını ve kurumasını önlemek için her gün agarose plakaüzerindeki suyu yenileyin. Tampon enjeksiyonları, ilgi geninin duyu teli karşı sentezlenen dsRNA enjeksiyonları ve hedef organizmaiçinde bulunmayan dizilere karşı sentezlenen dsRNA enjeksiyonları dahil olmak üzere dsRNA enjeksiyonları için uygun kontrolleri yapın. Ek moleküler yöntemler kullanarak RNAi nakavt teyit22. 5. DsRNA enjeksiyonları için T. marmoratus larvalarının hazırlanması NOT: Erken evre embriyoların aksine, T. marmoratus larvaları nispeten sağlamdır ve daha büyük hacimlerde enjekte edilebilir. Örneğin, ikinci yıldızlara 2 μL’ye kadar dsRNA çalışma çözeltisi ve üçüncü yıldız adedi en az 3 μL ile enjekte edilebilir ve hayatta kalma oranı üzerinde fark edilebilir olumsuz etkiler etüt edilemez. DSRNA enjekte etmek için, larvaları agarose’a yerleştirerek hareketsiz hale getirmek faydalıdır. Larvaları toplamadan önce, %2 agarose eritin ve sıvı halde tutmak için 60-70 °C’de bir su banyosunda saklayın. Küçük bir Petri kabına eritilmiş % 2 agarose dökerek bir immobilizasyon kabı hazırlayın ve katılaştırılına kadar soğutun. Enjekte edilecek her hayvan için agarose plaka (kabaca katıştırılmış eklembacaklı boyutu) sığ bir oluk yapmak için künt forseps kullanın. Uygun gelişim aşamasında genç larvaları toplayın (analiz için istenilen aşamadan bir aşamada önce). Bunu yapmak için, larva içeren kültür bardakları dikkatle su drenaj ve aşağıda belirtilen adımları izleyin. Buz üzerinde anestezi (dikkatle su bardağından larva dışarı almak ve yavaşça buz üzerine yerleştirin) larva kayda değer bir hareket gösterene kadar. Larvayı buzdan dikkatlice kaldırmak ve boynu ve gövdesi olukta, fakat kuyruğu agarose yüzeyinin üzerinde yer alan ve larvanın kuyruk kulelerinden nefes almaya devam etmesini sağlayan, kapalı olmayacak şekilde immobilizasyon aşamasına yerleştirmek için künt, yumuşak uçlu forsepsler kullanın. Hala sıvı ama tehlikeli sıcak değil agarose kalın bir tabaka ile larva kapağı. Yanlışlıkla kaplanmışsa, kuyruğu ve altındaki iki parçayı agarose’dan kurtarmak için püzifleri kullanın. Agarose katıladıktan sonra dsRNA enjeksiyonları için larva kullanın. 6. T. marmoratus larvalarında dsRNA mikroenjeksiyonları Bir mikroenjeksiyon iğnesini istenilen miktarda gen-spesifik dsRNA çalışma çözeltisi ile hazırlayın ve geri doldurun (4.1-4.2 adımlarında açıklandığı gibi). İğneyi elle kontrol edilen bir mikroenjeksiyon şırıngasına bağlı bir iğne tutucuya takın. İğneyi takmadan önce, enjeksiyon basıncının orta prosedürünün bitmemesi için şırınga pistonunu baştan dışarı çekin. Hareketsiz larvayı, üçüncü ve dördüncü gövde plakası segmentleri arasında yer alan enjeksiyon bölgesinin mikroenjeksiyon iğnesinin yörüngesiyle nispeten düz bir açıyla (sahneye neredeyse paralel) hizalandığı şekilde yerleştirin.NOT: İğne ve larvayı bu pozisyonda oltalamak önemlidir, çünkü iğne ucunun larvaları en az hasarla deliklepertisi için en az direnç sağlar. İğne ve larva konumlandırıldıktan sonra, bir stereomikroskop ile ilerlemeyi izlerken mikromanipülatör kullanarak iğne ucunu dikkatlice larvaya taşıyın. Ucu dokuyu deliklettikten sonra şırıngaya yavaşça ve dikkatlice basınç uygulayın. Mikroskop altında iğnerenkli enjeksiyon sıvısının hareketini gözlemleyerek enjeksiyon basıncını ayarlayın. İğneden sonra iğneyi dikkatlice geri çek. Soymak ve dolayısıyla agarose dan larva serbest yumuşak forceps kullanın. Larvayı su içeren bir kap içine geri aktarın (oda sıcaklığında) ve 25\u201228 °C’de bir kuluçka veya kültür odasında daha da gelişmesini ve 14 saat açık ve 10 saat karanlık bir ışık döngüsüne sahip olmasını bekleyin. Adım 4.10’da belirtildiği gibi uygun kontrol enjeksiyonları ve nakavt nicelikleri çalıştırın.