Establecer un modelo de córnea ex vivo porcina para estudiar tratamientos farmacológicos contra la queratitis bacteriana
Summary
Este artículo describe un protocolo paso a paso para establecer un modelo ex vivo porcino de queratitis bacteriana. Pseudomonas aeruginosa se utiliza como organismo prototípico. Este modelo innovador imita la infección in vivo, ya que la proliferación bacteriana depende de la capacidad de la bacteria para dañar el tejido corneal.
Abstract
Al desarrollar nuevos antimicrobianos, el éxito de los ensayos con animales depende de la extrapolación precisa de la eficacia antimicrobiana de las pruebas in vitro a las infecciones animales in vivo. Las pruebas in vitro existentes suelen sobreestimar la eficacia antimicrobiana, ya que no se tiene en cuenta la presencia de tejido huésped como barrera de difusión. Para superar este cuello de botella, hemos desarrollado un modelo corneal porcino ex vivo de queratitis bacteriana utilizando Pseudomonas aeruginosa como organismo prototípico. Este artículo describe la preparación de la córnea porcina y el protocolo para el establecimiento de la infección. Los moldes de vidrio a medida permiten una configuración sencilla de la córnea para estudios de infección. El modelo imita la infección in vivo, ya que la proliferación bacteriana depende de la capacidad de la bacteria para dañar el tejido corneal. El establecimiento de la infección se verifica como un aumento en el número de unidades formadoras de colonias evaluadas a través de recuentos de placas viables. Los resultados demuestran que la infección se puede establecer de una manera altamente reproducible en las córneas ex vivo utilizando el método descrito aquí. El modelo se puede extender en el futuro para imitar la queratitis causada por microorganismos distintos de P. aeruginosa. El objetivo final del modelo es investigar el efecto de la quimioterapia antimicrobiana en el progreso de la infección bacteriana en un escenario más representativo de las infecciones in vivo. Al hacerlo, el modelo descrito aquí reducirá el uso de animales para las pruebas, mejorará las tasas de éxito en los ensayos clínicos y, en última instancia, permitirá la traducción rápida de nuevos antimicrobianos a la clínica.
Introduction
Las infecciones corneales son causas importantes de ceguera y se producen en proporciones epidémicas en los países de ingresos bajos y medianos. La etiología de la enfermedad varía de una región a otra, pero las bacterias representan la gran mayoría de estos casos. Pseudomonas aeruginosa es un patógeno importante que causa una enfermedad rápidamente progresiva. En muchos casos, los pacientes se quedan con cicatrices estromales, astigmatismo irregular, requieren trasplante o en el peor de los casos, pierden un ojo1,2.
La queratitis bacteriana causada por P. aeruginosa es una infección ocular difícil de tratar particularmente debido a la creciente aparición de cepas resistentes a los antimicrobianos de P. aeruginosa. En la última década, se ha hecho evidente que las pruebas y el desarrollo de nuevos tratamientos para las infecciones corneales, en general, y los causados por Pseudomonas sp., en particular, son esenciales para combatir la tendencia actual en la resistencia a los antibióticos3.
Para la prueba de la eficacia de nuevos tratamientos para infecciones corneales, los métodos microbiológicos in vitro convencionales son un sustituto pobre debido a la diferencia en la fisiología bacteriana durante el cultivo de laboratorio y durante las infecciones in vivo, así como debido a la falta de la interfaz huésped4,5. Los modelos animales in vivo, sin embargo, son caros, que consumen mucho tiempo, sólo pueden ofrecer un pequeño número de réplicas y plantear preocupaciones sobre el bienestar animal.
En este artículo, demostramos un modelo de queratitis orgánica ex vivo organotípica simple y reproducible que se puede utilizar para probar varios tratamientos para infecciones agudas y crónicas. Hemos utilizado P. aeruginosa para este experimento, pero el modelo también funciona bien con otras bacterias, y organismos como hongos y levaduras que causan queratitis.
Protocol
Representative Results
Discussion
El principal impulsor del desarrollo de este modelo de queratitis utilizando córnea porcina ex vivo es proporcionar a los investigadores el desarrollo de nuevos antimicrobianos con un modelo in vitro representativo para determinar con mayor precisión la eficacia antimicrobiana en las etapas preclínicas. Esto proporcionará a los investigadores involucrados en el desarrollo de nuevos antimicrobianos un mayor control sobre el diseño y la formulación de fármacos en las etapas preclínicos, aumentar el éxito en los en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores quieren agradecer a Elliot Abattoir en Chesterfield por proporcionar ojos porcinos. Los anillos de vidrio fueron hechos basados en nuestro diseño por el soplador de vidrio Dan Jackson del Departamento de Química de la Universidad de Sheffield. Los autores quisieran agradecer al Consejo de Investigación Médica (MR/S004688/1) la financiación. Los autores también quieren agradecer a la Sra. Shanali Dikwella su ayuda técnica con la preparación de la córnea. Los autores quieren agradecer al Sr. Jonathan Emery la ayuda para dar formato a las imágenes.
Materials
| 50 mL Falcon tube | SLS | 352070 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Cellstar 12 well plate | Greiner Bio-One | 665180 | |
| Dextran | Sigma | 31425-100mg-F | |
| Distel | Fisher Scientific | 12899357 | |
| DMEM + glutamax | SLS | D0819 | |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal calf serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Handheld homogeniser 220 | Fisher Scientific | 15575809 | Homogeniser |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| LB agar | Sigma | L2897 | |
| Multitron | Infors | Not appplicable | Bacterial incubator |
| PBS | SLS | P4417 | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 12664785 | |
| Petri dish 35x10mm CytoOne | Starlab | CC7672-3340 | |
| Povidone iodine | Weldricks pharmacy | 2122828 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 |
References
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