Estabelecendo um modelo de córnea porcina ex vivo para estudar tratamentos medicamentosos contra ceratite bacteriana
Summary
Este artigo descreve um protocolo passo a passo para criar um modelo de ceratite porcina ex vivo de ceratite bacteriana. Pseudomonas aeruginosa é usado como organismo prototípico. Este modelo inovador imita a infecção in vivo, pois a proliferação bacteriana depende da capacidade da bactéria de danificar o tecido córnea.
Abstract
Ao desenvolver novos antimicrobianos, o sucesso dos ensaios em animais depende da extrapolação precisa da eficácia antimicrobiana de testes in vitro a infecções em animais in vivo. Os testes in vitro existentes tipicamente superestimam a eficácia antimicrobiana, pois a presença de tecido hospedeiro como barreira de difusão não é contabilizada. Para superar esse gargalo, desenvolvemos um modelo de ceratite bacteriana ex vivo porcina usando Pseudomonas aeruginosa como organismo prototipado. Este artigo descreve a preparação da córnea suína e o protocolo para o estabelecimento da infecção. Moldes de vidro sob medida permitem a configuração direta da córnea para estudos de infecção. O modelo imita a infecção in vivo, pois a proliferação bacteriana depende da capacidade da bactéria de danificar o tecido córnea. O estabelecimento da infecção é verificado como um aumento no número de unidades formadoras de colônias avaliadas por meio de placas viáveis. Os resultados demonstram que a infecção pode ser estabelecida de forma altamente reprodutível nas córneas ex vivo usando o método descrito aqui. O modelo pode ser estendido no futuro para imitar ceratite causada por microrganismos diferentes de P. aeruginosa. O objetivo final do modelo é investigar o efeito da quimioterapia antimicrobiana no progresso da infecção bacteriana em um cenário mais representativo de infecções in vivo. Ao fazê-lo, o modelo descrito aqui reduzirá o uso de animais para testes, melhorará as taxas de sucesso em ensaios clínicos e, finalmente, permitirá a tradução rápida de novos antimicrobianos para a clínica.
Introduction
As infecções corneais são importantes causas de cegueira e ocorrem em proporções epidêmicas em países de baixa e média renda. A etiologia da doença varia de região para região, mas as bactérias são responsáveis pela grande maioria desses casos. Pseudomonas aeruginosa é um patógeno importante que causa uma doença rapidamente progressiva. Em muitos casos, os pacientes ficam com cicatrizes estromais, astigmatismo irregular, necessitam de transplante ou, no pior dos casos, perdem um olho1,2.
A ceratite bacteriana causada pela P. aeruginosa é uma infecção ocular difícil de tratar particularmente devido ao crescente surgimento de cepas resistentes antimicrobianas de P. aeruginosa. Na última década, tornou-se evidente que testar e desenvolver novos tratamentos para infecções córneas, em geral, e aqueles causados por Pseudomonas sp., em particular, são essenciais para combater a tendência atual de resistência a antibióticos3.
Para testar a eficácia de novos tratamentos para infecções córneas, os métodos microbiológicos in vitro convencionais são um substituto ruim devido à diferença na fisiologia bacteriana durante a cultura laboratorial e durante infecções in vivo, bem como devido à falta da interface hospedeira4,5. Os modelos in vivo animal, no entanto, são caros, demorados, só podem entregar um pequeno número de réplicas e levantar preocupações sobre o bem-estar animal.
Neste artigo, demonstramos um modelo simples e reprodutível organotípico ex vivo porcina de ceratite que pode ser usado para testar vários tratamentos para infecções agudas e crônicas. Usamos P. aeruginosa para este experimento, mas o modelo também funciona bem com outras bactérias, e organismos como fungos e leveduras que causam ceratite.
Protocol
Representative Results
Discussion
O principal motor por trás do desenvolvimento deste modelo de ceratite usando córnea porcina ex vivo é fornecer aos pesquisadores que desenvolvem novos antimicrobianos com um modelo in vitro representativo para determinar com mais precisão a eficácia antimicrobiana nos estágios pré-clínicos. Isso fornecerá aos pesquisadores envolvidos no desenvolvimento de novos antimicrobianos maior controle sobre o design e formulação de medicamentos nos estágios pré-clínicos, aumentará o sucesso em ensaios clínicos, re…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer Elliot Abattoir em Chesterfield por fornecer olhos suínos. Os anéis de vidro foram feitos com base em nosso projeto pelo soprador de vidro Dan Jackson do Departamento de Química da Universidade de Sheffield. Os autores gostariam de agradecer ao Conselho de Pesquisa Médica (MR/S004688/1) pelo financiamento. Os autores também gostariam de agradecer à senhora deputada Shanali Dikwella pela ajuda técnica na preparação da córnea. Os autores gostariam de agradecer ao senhor deputado Jonathan Emery pela ajuda na formatação de imagens.
Materials
| 50 mL Falcon tube | SLS | 352070 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Cellstar 12 well plate | Greiner Bio-One | 665180 | |
| Dextran | Sigma | 31425-100mg-F | |
| Distel | Fisher Scientific | 12899357 | |
| DMEM + glutamax | SLS | D0819 | |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal calf serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Handheld homogeniser 220 | Fisher Scientific | 15575809 | Homogeniser |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| LB agar | Sigma | L2897 | |
| Multitron | Infors | Not appplicable | Bacterial incubator |
| PBS | SLS | P4417 | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 12664785 | |
| Petri dish 35x10mm CytoOne | Starlab | CC7672-3340 | |
| Povidone iodine | Weldricks pharmacy | 2122828 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 |
References
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