הקמת דגם חזיר אקס ויוו קרנית לחקר טיפולים תרופתיים נגד קרטיטיס בקטריאלי
Summary
מאמר זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב כדי להגדיר מודל אקס ויוו חזירי של קרטיטיס חיידקי. פסאודומונס ארוגינוזה משמש כאורגניזם אב-טיפוס. מודל חדשני זה מחקה זיהום vivo כמו התפשטות חיידקים תלויה ביכולתו של החיידק לפגוע ברקמת הקרנית.
Abstract
בעת פיתוח מיקרוביאלית חדשנית, ההצלחה של ניסויים בבעלי חיים תלויה אקסטרפולציה מדויקת של יעילות מיקרוביאלית מבדיקות במבחנה לזיהומים בבעלי חיים vivo. בדיקות במבחנה הקיימות בדרך כלל מעריכות יתר על המידה את היעילות האנטי-מיקרוביאלית מכיוון שנוכחות רקמה מארחת כמחסום דיפוזיה אינה נחשבת. כדי להתגבר על צוואר בקבוק זה, פיתחנו מודל הקרנית אקס ויוו חזירי של קרטיטיס חיידקי באמצעות Pseudomonas aeruginosa כאורגניזם אב טיפוס. מאמר זה מתאר את הכנת הקרנית חזירית ופרוטוקול להקמת הזיהום. תבניות זכוכית העידו לאפשר התקנה פשוטה של הקרנית למחקרי זיהום. המודל מחקה זיהום vivo כמו התפשטות חיידקים תלויה ביכולתו של החיידק לפגוע ברקמת הקרנית. הקמת זיהום מאומתת כגידול במספר יחידות יוצרות המושבה המוערכות באמצעות ספירת לוחיות רישוי בנות קיימא. התוצאות מראות כי זיהום ניתן להקים בצורה לשחזור מאוד בקרניות ex vivo באמצעות השיטה המתוארת כאן. המודל יכול להיות מורחב בעתיד לחקות קרטיטיס הנגרמת על ידי מיקרואורגניזמים שאינם P. aeruginosa. המטרה הסופית של המודל היא לחקור את ההשפעה של כימותרפיה מיקרוביאלית על ההתקדמות של זיהום חיידקי בתרחיש מייצג יותר של זיהומים in vivo. בכך, המודל המתואר כאן יפחית את השימוש בבעלי חיים לבדיקות, ישפר את שיעורי ההצלחה בניסויים קליניים ובסופו של דבר יאפשר תרגום מהיר של מיקרוביאליות חדשניות למרפאה.
Introduction
זיהומים בקרנית הם גורמים חשובים לעיוורון ומתרחשים בממדי מגיפה במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית. האטיולוגיה של המחלה משתנה מאזור לאזור אבל חיידקים מהווים רוב גדול של מקרים אלה. Pseudomonas aeruginosa הוא פתוגן חשוב שגורם למחלה מתקדמת במהירות. במקרים רבים, חולים נשארים עם צלקות סטרומה, אסטיגמציה לא סדירה, דורשים השתלה או בתרחיש הגרוע ביותר, לאבדעין 1,2.
קרטיטיס בקטריאלי הנגרם על ידי P. aeruginosa הוא זיהום עיניים קשה לטיפול במיוחד בשל הופעתה הגוברת של זנים עמידים מיקרוביאלית של P. aeruginosa. בעשור האחרון, התברר כי בדיקות ופיתוח טיפולים חדשים עבור זיהומים הקרנית, בכלל, ואלה הנגרמים על ידי Pseudomonas sp., בפרט, חיוניים כדי להילחם במגמה הנוכחית עמידות לאנטיביוטיקה3.
לבדיקת היעילות של טיפולים חדשים לזיהומים בקרנית, שיטות מיקרוביולוגיות במבחנה קונבנציונליות הן פונדקאית גרועה בשל ההבדל בפיזיולוגיה החיידקית במהלך תרבות המעבדה ובמהלך זיהומים ב vivo, כמו גם בשל היעדר ממשק המארח4,5. מודלים של בעלי חיים Vivo, לעומת זאת, הם יקרים, זמן רב, יכול רק לספק מספר קטן של משכפלים ולהעלות חששות לגבי רווחת בעלי החיים.
במאמר זה, אנו מדגימים פשוט לשחזור organotypic ex vivo דגם חזירי של קרטיטיס שניתן להשתמש בהם כדי לבדוק טיפולים שונים עבור זיהומים חריפים וכרוניים. השתמשנו P. aeruginosa עבור ניסוי זה, אבל המודל עובד גם היטב עם חיידקים אחרים, ואורגניזמים כגון פטריות ושמרים הגורמים קרטיטיס.
Protocol
Representative Results
Discussion
המניע העיקרי מאחורי הפיתוח של מודל זה קרטיטיס באמצעות הקרנית אקס ויוו חזירי היא לספק לחוקרים פיתוח antimicrobials הרומן עם מודל במבחנה נציג כדי לקבוע בצורה מדויקת יותר יעילות מיקרוביאלית בשלבים הפרה-קוליניים. זה יספק לחוקרים המעורבים בפיתוח מיקרוביאלים חדשים שליטה רבה יותר על תכנון וניסוח תרו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לאליוט אבטואר בצ’סטרפילד על שסיפק עיניים חזיריות. טבעות הזכוכית נעשו על סמך העיצוב שלנו על ידי מפוח הזכוכית דן ג’קסון מהמחלקה לכימיה באוניברסיטת שפילד. המחברים מבקשים להודות למועצה למחקר רפואי (MR/S004688/1) על המימון. המחברים רוצים גם להודות לגברת שאנלי דיקוולה על העזרה הטכנית בהכנת הקרנית. המחברים רוצים להודות למר ג’ונתן אמרי על העזרה בעיצוב תמונות.
Materials
| 50 mL Falcon tube | SLS | 352070 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Cellstar 12 well plate | Greiner Bio-One | 665180 | |
| Dextran | Sigma | 31425-100mg-F | |
| Distel | Fisher Scientific | 12899357 | |
| DMEM + glutamax | SLS | D0819 | |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal calf serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Handheld homogeniser 220 | Fisher Scientific | 15575809 | Homogeniser |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| LB agar | Sigma | L2897 | |
| Multitron | Infors | Not appplicable | Bacterial incubator |
| PBS | SLS | P4417 | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 12664785 | |
| Petri dish 35x10mm CytoOne | Starlab | CC7672-3340 | |
| Povidone iodine | Weldricks pharmacy | 2122828 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 |
References
- Vazirani, J., Wurity, S., Ali, M. H. Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Keratitis Risk Factors, Clinical Characteristics, and Outcomes. Ophthalmology. 122 (10), 2110-2114 (2015).
- Sharma, S. Keratitis. Bioscience Reports. 21 (4), 419-444 (2001).
- Sharma, G., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm: Potential therapeutic targets. Biologicals. 42 (1), 1-7 (2014).
- Ersoy, S. C., et al. Correcting a Fundamental Flaw in the Paradigm for Antimicrobial Susceptibility Testing. EBioMedicine. 20, 173-181 (2017).
- Kubicek-Sutherland, J. Z., et al. Host-dependent Induction of Transient Antibiotic Resistance: A Prelude to Treatment Failure. EBioMedicine. 2 (9), 1169-1178 (2015).
- Pinnock, A., et al. Ex vivo rabbit and human corneas as models for bacterial and fungal keratitis. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 255 (2), 333-342 (2017).
- Harman, R. M., Bussche, L., Ledbetter, E. C., Van de Walle, G. R. Establishment and Characterization of an Air-Liquid Canine Corneal Organ Culture Model To Study Acute Herpes Keratitis. Journal of Virology. 88 (23), 13669-13677 (2014).
- Madhu, S. N., Jha, K. K., Karthyayani, A. P., Gajjar, D. U. Ex vivo Caprine Model to Study Virulence Factors in Keratitis. Journal of Ophthalmic & Vision Research. 13 (4), 383-391 (2018).
- Vermeltfoort, P. B. J., van Kooten, T. G., Bruinsma, G. M., Hooymans, A. M. M., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Bacterial transmission from contact lenses to porcine corneas: An ex vivo study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (6), 2042-2046 (2005).
- Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
- Brothers, K., et al. Bacterial Impediment of Corneal Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (7), (2015).
- Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. Ex vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Sack, R. A., Nunes, I., Beaton, A., Morris, C. Host-Defense Mechanism of the Ocular Surfaces. Bioscience Reports. 21 (4), 463-480 (2001).
- Kunzmann, B. C., et al. Establishment of a porcine corneal endothelial organ culture model for research purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
- Oh, J. Y., et al. Processing Porcine Cornea for Biomedical Applications. Tissue Engineering Part C-Methods. 15 (4), 635-645 (2009).
- Shi, W. Y., et al. Protectively Decellularized Porcine Cornea versus Human Donor Cornea for Lamellar Transplantation. Advanced Functional Materials. 29, 1902491-1902503 (2019).
- Menduni, F., Davies, L. N., Madrid-Costa, D., Fratini, A., Wolffsohn, J. S. Characterisation of the porcine eyeball as an in-vitro model for dry eye. Contact Lens & Anterior Eye. 41 (1), 13-17 (2018).
- Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
