Создание porcine Ex Vivo Cornea Модель для изучения лечения наркомании против бактериального кератита
Summary
В этой статье описывается пошаговой протокол для настройки ex vivo свиной модели бактериального кератита. Pseudomonas aeruginosa используется в качестве прототипа организма. Эта инновационная модель имитирует инфекцию in vivo, поскольку бактериальная пролиферция зависит от способности бактерии повредить ткани роговицы.
Abstract
При разработке новых противомикробных препаратов успех испытаний на животных зависит от точной экстраполяции эффективности противомикробных препаратов от тестов in vitro до инфекций животных in vivo. Существующие тесты in vitro обычно переоценивают эффективность противомикробных препаратов, поскольку наличие ткани-хозяина в качестве диффузионные барьеры не учитывается. Чтобы преодолеть это узкое место, мы разработали ex vivo свиной роговицы модель бактериального кератита с использованием Pseudomonas aeruginosa в качестве прототипа организма. В этой статье описывается подготовка свиной роговицы и протокол для установления инфекции. Индивидуальные стеклянные формы позволяют простой установки роговицы для исследования инфекции. Модель имитирует инфекцию in vivo, так как бактериальная пролиферция зависит от способности бактерии повредить ткани роговицы. Установление инфекции проверяется как увеличение числа колоний, образующих единицы, оцениваемые с помощью жизнеспособных подсчетов пластин. Результаты показывают, что инфекция может быть установлена в весьма воспроизводимой моды в ex vivo роговицы с использованием метода, описанного здесь. Модель может быть расширена в будущем, чтобы имитировать кератит, вызванный микроорганизмами, кроме P. aeruginosa. Конечная цель модели заключается в расследовании влияния противомикробной химиотерапии на прогресс бактериальной инфекции в сценарии более представительный инфекций in vivo. При этом описанная здесь модель позволит сократить использование животных для тестирования, повысить показатели успешности клинических испытаний и в конечном итоге обеспечить быстрый перевод новых противомикробных препаратов в клинику.
Introduction
Инфекции роговицы являются важными причинами слепоты и происходят в масштабах эпидемии в странах с низким и средним уровнем дохода. Этиология заболевания варьируется от региона к региону, но бактерии составляют подавляющее большинство этих случаев. Pseudomonas aeruginosa является важным патогеном, который вызывает быстро прогрессирующее заболевание. Во многих случаях пациенты остаются с стромальными рубцами, нерегулярным астигматизмом, требуют пересадки или в худшем случае теряютглаз 1,2.
Бактериальный кератит, вызванный P. aeruginosa является трудно глазной инфекции для лечения особенно в связи с увеличением появления противомикробных устойчивых штаммов P. aeruginosa. В течение последнего десятилетия, стало очевидно, что тестирование и разработка новых методов лечения инфекций роговицы, в целом, и те, вызванные Pseudomonas sp., в частности, имеют важное значение для борьбы с нынешней тенденцией в устойчивости кантибиотикам 3.
Для тестирования эффективности новых методов лечения инфекций роговицы, обычные микробиологические методы in vitro являются плохой суррогатной из-за разницы в бактериальной физиологии во время лабораторной культуры и во время инфекций in vivo, а также из-за отсутствияинтерфейса хозяина 4,5. В vivo животных моделей, однако, являются дорогостоящими, трудоемкими, может доставить лишь небольшое количество репликаций и поднять озабоченность по поводу благополучия животных.
В этой статье мы демонстрируем простую и воспроизводимую органотипную модель свинины ex vivo, которая может быть использована для тестирования различных методов лечения острых и хронических инфекций. Мы использовали P. aeruginosa для этого эксперимента, но модель также хорошо работает с другими бактериями, и организмы, такие как грибы и дрожжи, которые вызывают кератит.
Protocol
Representative Results
Discussion
Основной причиной разработки этой модели кератита с использованием ex vivo свиной роговицы является предоставление исследователям, разрабатывая новые противомикробные препараты с репрезентативной моделью in vitro для более точного определения эффективности противомикробных препаратов ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Эллиота Абаттуара в Честерфилде за предоставление свиных глаз. Стеклянные кольца были сделаны на основе нашего дизайна стеклодувом Дэном Джексоном (Dan Jackson) из химического факультета Шеффилдского университета. Авторы хотели бы поблагодарить Совет медицинских исследований (MR/S004688/1) за финансирование. Авторы также хотели бы поблагодарить г- жу Шанали Диквеллу за техническую помощь в подготовке роговицы. Авторы хотели бы поблагодарить г-на Джонатана Эмери за помощь в форматировании фотографий.
Materials
| 50 mL Falcon tube | SLS | 352070 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Cellstar 12 well plate | Greiner Bio-One | 665180 | |
| Dextran | Sigma | 31425-100mg-F | |
| Distel | Fisher Scientific | 12899357 | |
| DMEM + glutamax | SLS | D0819 | |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal calf serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Handheld homogeniser 220 | Fisher Scientific | 15575809 | Homogeniser |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| LB agar | Sigma | L2897 | |
| Multitron | Infors | Not appplicable | Bacterial incubator |
| PBS | SLS | P4417 | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 12664785 | |
| Petri dish 35x10mm CytoOne | Starlab | CC7672-3340 | |
| Povidone iodine | Weldricks pharmacy | 2122828 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 |
References
- Vazirani, J., Wurity, S., Ali, M. H. Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Keratitis Risk Factors, Clinical Characteristics, and Outcomes. Ophthalmology. 122 (10), 2110-2114 (2015).
- Sharma, S. Keratitis. Bioscience Reports. 21 (4), 419-444 (2001).
- Sharma, G., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm: Potential therapeutic targets. Biologicals. 42 (1), 1-7 (2014).
- Ersoy, S. C., et al. Correcting a Fundamental Flaw in the Paradigm for Antimicrobial Susceptibility Testing. EBioMedicine. 20, 173-181 (2017).
- Kubicek-Sutherland, J. Z., et al. Host-dependent Induction of Transient Antibiotic Resistance: A Prelude to Treatment Failure. EBioMedicine. 2 (9), 1169-1178 (2015).
- Pinnock, A., et al. Ex vivo rabbit and human corneas as models for bacterial and fungal keratitis. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 255 (2), 333-342 (2017).
- Harman, R. M., Bussche, L., Ledbetter, E. C., Van de Walle, G. R. Establishment and Characterization of an Air-Liquid Canine Corneal Organ Culture Model To Study Acute Herpes Keratitis. Journal of Virology. 88 (23), 13669-13677 (2014).
- Madhu, S. N., Jha, K. K., Karthyayani, A. P., Gajjar, D. U. Ex vivo Caprine Model to Study Virulence Factors in Keratitis. Journal of Ophthalmic & Vision Research. 13 (4), 383-391 (2018).
- Vermeltfoort, P. B. J., van Kooten, T. G., Bruinsma, G. M., Hooymans, A. M. M., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Bacterial transmission from contact lenses to porcine corneas: An ex vivo study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (6), 2042-2046 (2005).
- Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
- Brothers, K., et al. Bacterial Impediment of Corneal Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (7), (2015).
- Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. Ex vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Sack, R. A., Nunes, I., Beaton, A., Morris, C. Host-Defense Mechanism of the Ocular Surfaces. Bioscience Reports. 21 (4), 463-480 (2001).
- Kunzmann, B. C., et al. Establishment of a porcine corneal endothelial organ culture model for research purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
- Oh, J. Y., et al. Processing Porcine Cornea for Biomedical Applications. Tissue Engineering Part C-Methods. 15 (4), 635-645 (2009).
- Shi, W. Y., et al. Protectively Decellularized Porcine Cornea versus Human Donor Cornea for Lamellar Transplantation. Advanced Functional Materials. 29, 1902491-1902503 (2019).
- Menduni, F., Davies, L. N., Madrid-Costa, D., Fratini, A., Wolffsohn, J. S. Characterisation of the porcine eyeball as an in-vitro model for dry eye. Contact Lens & Anterior Eye. 41 (1), 13-17 (2018).
- Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
