Burada, diyasilgliseril peptid ve alkin-fosfolipitleri klik-kimyası ile substrat olarak kullanarak apolipoprotein N-asiltransferaz aktivitesini izlemek için hassas bir floresan testi sunulmaktadır.
Proteobakterilerden lipoproteinler, üç integral membran enziminin etkisiyle membran fosfolipitlerinden türetilen yağ asitleri tarafından posttranslasyonel olarak modifiye edilir ve triasile proteinlerle sonuçlanır. Lipoprotein modifikasyon yolundaki ilk adım, bir diasilgliseril grubunun fosfatidilgliserolden prolipoproteine transferini içerir ve bu da diasilgliseril prolipoprotein ile sonuçlanır. İkinci adımda, prolipoproteinin sinyal peptidi bölünür ve bir fosfolipitten türetilen üçüncü bir yağ asidi tarafından modifiye edilen bir apolipoprotein oluşturulur. Bu son adım apolipoprotein N-asiltransferaz (Lnt) tarafından katalize edilir. Lipoprotein modifikasyon yolu, çoğu γ-proteobakteride esastır ve bu da onu yeni antibakteriyel ajanların gelişimi için potansiyel bir hedef haline getirir. Burada açıklanan, küçük inhibitör moleküllerin yüksek verimli taraması ile uyumlu olan Lnt için hassas bir testtir. Enzim ve substratlar membrana gömülü moleküllerdir; bu nedenle, in vitro bir testin geliştirilmesi kolay değildir. Bu, aktif enzimin deterjan varlığında saflaştırılmasını, alkin-fosfolipitlerin ve diasilgliseril peptid substratlarının mevcudiyetini ve karışık misellerdeki reaksiyon koşullarını içerir. Ayrıca, aktivite testini yüksek verimli bir tarama (HTS) kurulumunda kullanmak için, reaksiyon ürününün doğrudan okunması, birleştirilmiş enzimatik reaksiyonlara göre tercih edilir. Bu florometrik enzim testinde, alkin-triasile peptid ürünü, bir tıklama-kimya reaksiyonu yoluyla floresan haline getirilir ve çok kuyulu bir plaka formatında tespit edilir. Bu yöntem, fosfolipitler ve açil-CoA dahil olmak üzere yağ asidi içeren substratlar kullanan diğer asiltransferazlar için geçerlidir.
Bakteriyel lipoproteinler, amino terminlerinde kovalent olarak bağlanmış yağ asitleri ile karakterize edilir ve bu asitler 1,2 membranlarına sabitlenir. Proteinin olgun kısmı yapı ve işlev bakımından oldukça çeşitlidir, böylece lipoproteinlerin bakteriyel hücre zarfındaki çeşitli biyolojik süreçlerdeki rolünü açıklar.
Lipoproteinler, sitoplazmik membrana yerleştirildikten sonra fosfolipid kaynaklı yağ asitleri tarafından modifiye edilir. Prolipoproteinler, asillenmiş hale gelen değişmez bir sistein kalıntısı ve olgun proteindeki ilk amino asit içeren bir imza motifi olan lipobox içerir. Bu yolun ilk adımı, diasilgliseril grubunu fosfatidilgliserolden prolipoproteine diyasilgliseril ve sistein arasındaki bir tiyoeter bağlantısı yoluyla prolipoproteine aktaran prolipoprotein fosfatidilgliserol::d iasilgliseril transferaz (Lgt) tarafından katalize edilir. Sinyal peptidaz II (Lsp), sinyal peptidini diasilgliseril prolipoproteinden ayırır ve diasilgliserl moiety yoluyla membrana demirlenen bir apolipoprotein ile sonuçlanır. Üçüncü ve son adım, fosfolipitin sn-1 pozisyonundan apolipoprotein üzerine bir yağ asidi ekleyen ve triasile olgun lipoprotein ile sonuçlanan apolipoprotein N-asiltransferaz (Lnt) tarafından katalize edilir (Şekil 1)3. Lnt reaksiyonu, kararlı bir tiyoester açil enzim ara ürününün oluştuğu iki aşamalı bir pinpon reaksiyonudur. Lizofosfolipid yan ürünü, reaksiyonun ikinci adımında apolipoprotein substratının asilasyonundan önce salınır.
Fosfolipid substrat özgüllüğü, yüksek oranda Tris-Trisin Üre SDS-PAGE4 üzerinde N-açil diasilgliseril peptidin hareketlilik kaymasına dayanan bir Lnt testinde belirlenir. Küçük polar kafa gruplarına sahip, doymuş [sn-1] ve doymamış [sn-2] fosfolipitler tercih edilen substratlar4’tür. Jel kayma testi, apolipoprotein N-asiltransferazın kapsamlı kinetik çalışmaları veya HTS’nin inhibitör molekülleri tanımlaması için uygun değildir. Alkinli yağ asitlerini kullanan tıklama kimyası, bakteri5’te lipoprotein modifikasyonunu ve ökaryotlarda yağ asidi metabolizmasını incelemek için başarıyla kullanılmıştır6. Son zamanlarda, inhibitörleri7 tanımlamak için Ras palmitoylasyonunun in vitro bir testinin bildirildiği bildirilmiştir.
Burada açıklanan yöntemde, deterjandaki saflaştırılmış aktif Lnt, daha sonra floresan spektrometrisi ile tespit edilen alkin-triasile peptid oluşturmak için karışık misellerdeki substratlarla inkübe edilir.
Triasillenmiş ürünün floresan tespitine dayanan burada açıklanan Lnt testi protokolü hassas ve tekrarlanabilirdir. Biotin’in streptavidin’e spesifik ve verimli bağlanması, tahlilde kilit bir unsurdur. Lnt reaksiyonunun tamamlanmasından sonra bırakılan alkin-POPE substratı da FAM ile floresan olarak etiketlenir, ancak streptavidin plakalarına çoklu yıkama adımlarıyla bağlandıktan sonra verimli bir şekilde çıkarılır. Ayrıca, DMSO’nun eklenmesi Lnt aktivitesini etkilemez ve tahlil üzerinde hiçbir…
The authors have nothing to disclose.
Kemogenomik ve Biyolojik Tarama Platformu’ndan Fabrice Agou ve Alix Boucharlat’a, Institut Pasteur Paris’teki Teknolojik Kaynaklar ve Araştırma Merkezi’ne (C2RT) protokol hakkında yararlı öneriler için, BGPB Birimi’nin tüm üyelerine destek ve bilimsel tartışmalar için ve Simon Legood’a makalenin eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Çalışma, Carnot Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü ve Carnot Mikropları ve Sağlığı Enstitüsü’nün Küresel Bakım Girişimleri (15 CARN 0017-01 ve 16 CARN 0023-01) tarafından finanse edilmiştir.
Äkta Purifier FPLC system | GE Healthcare | NA | Purity: NA Lnt purification |
alkyne-POPE | Avanti Polar Lipids | 900414P | Purity: >99% Lnt substrate |
Azido-FAM | Lumiprobe | A4130 | Purity: 100% (pure) Click reagent |
BioPhotometer Plus | Eppendorf | N/A | Purity: NA OD 600 nm |
BioTek ELX 405 Select plate washer | BioTek | N° serie 115800, n° materiel 405 Select | Purity: NA Wash steps |
biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | Purity: ≥90% Fluorescence control |
Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma | C3036 | Purity: ≥98% Click reagent |
DDM | Anatrace | D310A | Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergent for Lnt purification |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Invitrogen | D12435 | Purity: anhydrous Solbilization Click reagent |
Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL | INTEGRA | 4721 | Purity: NA Handling reagents |
French Pressure Cell | N/A | N/A | Purity: NA Cell disruption |
FSL-1-biotin | EMC microcollections | L7030 | Purity: NA Lnt substrate |
Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate | Greiner | 781091 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding | Greiner | 655097 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
Microplate reader Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) | Anatrace | S110MT | Purity: ~100% Thiol specific inhibitor |
Optically Clear Adhesive Seal Sheets | Thermo Scientific | AB-1170 | Purity: NA Foil to seal multi-well plate |
Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column | GE Healthcare | GE28-9356-04 | Purity: NA Lnt purification |
StrepTactin Sepharose 50 % | IBA Biotechnology | 2-1201-010 | Purity: NA Lnt purification |
streptavidin | Sigma | S4762-1MG | Purity: ≥13 units/mg protein Biotin binding |
TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine | Sigma | 678937 | Purity: 97% Click reagent |
TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma | 75259 | Purity: ≥98% Click reagent |
TECAN Infinite F500 | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
TECAN Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | Purity: NA Heated lid |
Triton X-100 | Sigma | 93443 | Purity: 10% in H2O Lnt reaction buffer |
Ultra centrifuge | Beckman LC | N/A | Purity: NA Cell fractionation |