Klickchemischer fluorometrischer Assay für Apolipoprotein-N-Acyltransferase von der Enzymcharakterisierung bis zum Hochdurchsatz-Screening
Summary
Hier wird ein sensitiver Fluoreszenztest zur Überwachung der Apolipoprotein-N-Acyltransferase-Aktivität unter Verwendung von Diacylglycerylpeptid und Alkin-Phospholipiden als Substrate mit Klickchemie vorgestellt.
Abstract
Lipoproteine aus Proteobakterien werden posttranslational durch Fettsäuren modifiziert, die aus Membranphospholipiden durch die Wirkung von drei integralen Membranenzymen gewonnen werden, was zu triacylierten Proteinen führt. Der erste Schritt im Lipoproteinmodifikationsweg beinhaltet die Übertragung einer Diacylglycerylgruppe von Phosphatidylglycerol auf das Prolipoprotein, was zu Diacylglycerylprolipoprotein führt. Im zweiten Schritt wird das Signalpeptid des Prolipoproteins gespalten und bildet ein Apolipoprotein, das wiederum durch eine dritte Fettsäure aus einem Phospholipid modifiziert wird. Dieser letzte Schritt wird durch Apolipoprotein N-Acyltransferase (Lnt) katalysiert. Der Lipoprotein-Modifikationsweg ist in den meisten γ-Proteobakterien essentiell und damit ein potenzielles Ziel für die Entwicklung neuartiger antibakterieller Wirkstoffe. Hier wird ein sensitiver Assay für Lnt beschrieben, der mit dem Hochdurchsatz-Screening kleiner inhibitorischer Moleküle kompatibel ist. Das Enzym und die Substrate sind membraneingebettete Moleküle; Daher ist die Entwicklung eines In-vitro-Tests nicht einfach. Dazu gehören die Reinigung des aktiven Enzyms in Gegenwart von Detergens, die Verfügbarkeit von Alkin-Phospholipiden und Diacylglycerylpeptidsubstraten sowie die Reaktionsbedingungen in gemischten Mizellen. Um den Aktivitätstest in einem Hochdurchsatz-Screening (HTS) zu verwenden, wird außerdem das direkte Auslesen des Reaktionsprodukts gegenüber gekoppelten enzymatischen Reaktionen bevorzugt. In diesem fluorometrischen Enzymassay wird das alkintriacylierte Peptidprodukt durch eine Klickchemiereaktion fluoreszierend gemacht und in einem Multiwell-Plattenformat detektiert. Diese Methode ist auf andere Acyltransferasen anwendbar, die fettsäurehaltige Substrate verwenden, einschließlich Phospholipide und Acyl-CoA.
Introduction
Bakterielle Lipoproteine sind durch kovalent gebundene Fettsäuren an ihren Aminotermini gekennzeichnet, durch die sie in Membranenverankert sind 1,2. Der reife Teil des Proteins ist in Struktur und Funktion sehr vielfältig, was die Rolle von Lipoproteinen in verschiedenen biologischen Prozessen in der bakteriellen Zellhülle erklärt.
Lipoproteine werden durch Phospholipid-abgeleitete Fettsäuren nach dem Einbringen in die zytoplasmatische Membran modifiziert. Die Prolipoproteine enthalten ein Signaturmotiv, die Lipobox, die einen invarianten Cysteinrest enthält, der acyliert wird, und die erste Aminosäure im reifen Protein. Der erste Schritt dieses Weges wird durch Prolipoprotein Phosphatidylglycerol::d Iacylglyceryltransferase (Lgt) katalysiert, die die Diacylglycerylgruppe von Phosphatidylglycerol auf das Prolipoprotein über eine Thioetherverbindung zwischen Diacylglyceryl und Cystein überträgt. Die Signalpeptidase II (Lsp) spaltet das Signalpeptid vom Diacylglyceryl-Prolipoprotein, was zu einem Apolipoprotein führt, das durch seinen Diacylglycerylanteil in der Membran verankert ist. Der dritte und letzte Schritt wird durch Apolipoprotein N-Acyltransferase (Lnt) katalysiert, die eine Fettsäure aus der sn-1-Position des Phospholipids an Apolipoprotein hinzufügt, was zu triacyliertem reifem Lipoprotein führt (Abbildung 1)3. Die Lnt-Reaktion ist eine zweistufige Ping-Pong-Reaktion, bei der ein stabiles Thioester-Acylenzym-Zwischenprodukt gebildet wird. Das Lysophospholipid-Nebenprodukt wird vor der Acylierung des Apolipoproteinsubstrats im zweiten Schritt der Reaktion freigesetzt.
Die Phospholipidsubstratspezifität wird in einem Lnt-Assay basierend auf der Mobilitätsverschiebung des N-Acyldiacylglycerylpeptids auf einem hochprozentigen Tris-Tricin-Harnstoff SDS-PAGE4 bestimmt. Phospholipide mit kleinen polaren Kopfgruppen, gesättigt [sn-1] und nicht gesättigt [sn-2], waren bevorzugte Substrate4. Der Gelverschiebungstest eignet sich weder für umfangreiche kinetische Studien der Apolipoprotein-N-Acyltransferase noch für HTS zur Identifizierung hemmender Moleküle. Die Klickchemie unter Verwendung von Alkinfettsäuren wurde erfolgreich eingesetzt, um die Lipoproteinmodifikation in Bakterien5 und den Fettsäurestoffwechsel in Eukaryoten6 zu untersuchen. Vor kurzem wurde ein In-vitro-Assay der Ras-Palmitoylierung berichtet, um Inhibitoren zu identifizieren7.
Bei dem hier beschriebenen Verfahren wird gereinigtes aktives Lnt in Waschmittel mit Substraten in gemischten Mizellen inkubiert, um alkintriacyliertes Peptid zu bilden, das anschließend durch Fluoreszenzspektrometrie nachgewiesen wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll für den Lnt-Assay, basierend auf der Fluoreszenzdetektion des triacylierten Produkts, ist sensitiv und reproduzierbar. Die spezifische und effiziente Bindung von Biotin an Streptavidin ist ein Schlüsselelement des Assays. Alkin-POPE-Substrat, das nach Abschluss der Lnt-Reaktion übrig bleibt, wird ebenfalls fluoreszierend mit FAM markiert, aber nach der Bindung an die Streptavidinplatten durch mehrere Waschschritte effizient entfernt. Darüber hinaus hat die Zugabe von DMSO keinen Einflu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Fabrice Agou und Alix Boucharlat von der Chemogenomic and Biological Screening Platform, Center for Technological Resources and Research (C2RT) am Institut Pasteur Paris für hilfreiche Vorschläge zum Protokoll, allen Mitgliedern der BGPB-Einheit für Unterstützung und wissenschaftliche Diskussionen und Simon Legood für die kritische Lektüre des Manuskripts. Die Arbeit wurde von Global Care Initiatives des Instituts Carnot Infektionskrankheiten und des Instituts Carnot Microbes and Health finanziert (15 CARN 0017-01 und 16 CARN 0023-01).
Materials
| Äkta Purifier FPLC system | GE Healthcare | NA | Purity: NA Lnt purification |
| alkyne-POPE | Avanti Polar Lipids | 900414P | Purity: >99% Lnt substrate |
| Azido-FAM | Lumiprobe | A4130 | Purity: 100% (pure) Click reagent |
| BioPhotometer Plus | Eppendorf | N/A | Purity: NA OD 600 nm |
| BioTek ELX 405 Select plate washer | BioTek | N° serie 115800, n° materiel 405 Select | Purity: NA Wash steps |
| biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | Purity: ≥90% Fluorescence control |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma | C3036 | Purity: ≥98% Click reagent |
| DDM | Anatrace | D310A | Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergent for Lnt purification |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Invitrogen | D12435 | Purity: anhydrous Solbilization Click reagent |
| Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL | INTEGRA | 4721 | Purity: NA Handling reagents |
| French Pressure Cell | N/A | N/A | Purity: NA Cell disruption |
| FSL-1-biotin | EMC microcollections | L7030 | Purity: NA Lnt substrate |
| Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate | Greiner | 781091 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding | Greiner | 655097 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Microplate reader Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) | Anatrace | S110MT | Purity: ~100% Thiol specific inhibitor |
| Optically Clear Adhesive Seal Sheets | Thermo Scientific | AB-1170 | Purity: NA Foil to seal multi-well plate |
| Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column | GE Healthcare | GE28-9356-04 | Purity: NA Lnt purification |
| StrepTactin Sepharose 50 % | IBA Biotechnology | 2-1201-010 | Purity: NA Lnt purification |
| streptavidin | Sigma | S4762-1MG | Purity: ≥13 units/mg protein Biotin binding |
| TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine | Sigma | 678937 | Purity: 97% Click reagent |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma | 75259 | Purity: ≥98% Click reagent |
| TECAN Infinite F500 | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| TECAN Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | Purity: NA Heated lid |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | Purity: 10% in H2O Lnt reaction buffer |
| Ultra centrifuge | Beckman LC | N/A | Purity: NA Cell fractionation |
References
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