Summary

الفحص الفلوري القائم على كيمياء النقر ل Apolipoprotein N-acyltransferase من توصيف الإنزيم إلى الفحص عالي الإنتاجية

Published: May 13, 2020
doi:

Summary

يظهر هنا مقايسة مضان حساسة لمراقبة نشاط البروتين الشحمي N-acyltransferase باستخدام ببتيد ثنائي أسيل جليسريل وألكاين فوسفوليبيدات كركائز مع كيمياء النقر.

Abstract

يتم تعديل البروتينات الدهنية من البكتيريا البروتينية بعد الترجمة بواسطة الأحماض الدهنية المشتقة من الدهون الفوسفاتية الغشائية عن طريق عمل ثلاثة إنزيمات غشائية متكاملة ، مما ينتج عنه بروتينات ثلاثية الأسيلات. تتضمن الخطوة الأولى في مسار تعديل البروتين الدهني نقل مجموعة دياسيل جليسريل من فوسفاتيديل جليسرول إلى البروتين البروتيني ، مما ينتج عنه بروتين بروليبوبروتين ثنائي الغليسيريل. في الخطوة الثانية ، يتم شق ببتيد إشارة البروتين البروتيني ، مكونا بروتين شحمي ، والذي بدوره يتم تعديله بواسطة حمض دهني ثالث مشتق من الفوسفوليبيد. يتم تحفيز هذه الخطوة الأخيرة بواسطة صميم البروتين الشحمي N-acyltransferase (Lnt). يعد مسار تعديل البروتين الدهني ضروريا في معظم البكتيريا البروتينية γ ، مما يجعله هدفا محتملا لتطوير عوامل مضادة للبكتيريا جديدة. الموصوف هنا هو اختبار حساس ل Lnt متوافق مع الفحص عالي الإنتاجية للجزيئات المثبطة الصغيرة. الإنزيم والركائز هي جزيئات مدمجة في الغشاء. لذلك ، فإن تطوير اختبار في المختبر ليس بالأمر السهل. وهذا يشمل تنقية الإنزيم النشط في وجود المنظفات ، وتوافر الألكاين الفوسفوليبيد وركائز الببتيد ثنائي الغليسيريل ، وظروف التفاعل في المذيلات المختلطة. علاوة على ذلك ، من أجل استخدام اختبار النشاط في إعداد فحص عالي الإنتاجية (HTS) ، تفضل القراءة المباشرة لمنتج التفاعل على التفاعلات الأنزيمية المقترنة. في مقايسة الإنزيم الفلورومترية هذه ، يتم تحويل منتج الببتيد ثلاثي الكيلات إلى الفلورسنت من خلال تفاعل كيمياء النقر ويتم اكتشافه في شكل لوحة متعددة الآبار. تنطبق هذه الطريقة على أسيلترانسفيراز الأخرى التي تستخدم ركائز تحتوي على الأحماض الدهنية ، بما في ذلك الدهون الفوسفاتية وأسيل-CoA.

Introduction

تتميز البروتينات الدهنية البكتيرية بالأحماض الدهنية المرتبطة تساهميا في أمينو تيرميني والتي يتم من خلالها تثبيتها في الأغشية 1,2. الجزء الناضج من البروتين متنوع للغاية في البنية والوظيفة ، مما يفسر دور البروتينات الدهنية في العمليات البيولوجية المختلفة في غلاف الخلية البكتيرية.

يتم تعديل البروتينات الدهنية بواسطة الأحماض الدهنية المشتقة من الفوسفوليبيد بعد إدخالها في الغشاء السيتوبلازمي. تحتوي البروتينات البروليبوبروتينية على شكل مميز ، وهو lipobox ، والذي يحتوي على بقايا سيستين ثابتة تصبح أسيلية وأول حمض أميني في البروتين الناضج. يتم تحفيز الخطوة الأولى من هذا المسار بواسطة البروتين البروليبوبروتين فوسفاتيديل جليسرول: :d iacylglyceryl transferase (Lgt) ، الذي ينقل مجموعة diacylglyceryl من phosphatidylglycerol إلى البروتين البروليبوبروتين عبر رابط ثيوثير بين دياسيل جليسريل والسيستين. إشارة الببتيداز II (Lsp) تشق ببتيد الإشارة من البروتين البروليبوبروتين ثنائي الأسيل غليسيريل ، مما ينتج عنه بروتين شحمي مثبت في الغشاء من خلال مجموعة دياسيل جليسيريل. يتم تحفيز الخطوة الثالثة والأخيرة بواسطة صميم البروتين الشحمي N-acyltransferase (Lnt) ، والذي يضيف حمضا دهنيا من موضع sn-1 من الفوسفوليبيد على صميم البروتين الشحمي ، مما ينتج عنه بروتين دهني ناضج ثلاثي الأضلاع (الشكل 1) 3. تفاعل Lnt هو تفاعل بينج بونج من خطوتين حيث يتم تكوين وسيط إنزيم أسيل ثيوستر مستقر. يتحرر الناتج الثانوي لليسوفوفوسفوليبيد قبل تسيل ركيزة البروتين الشحمي في الخطوة الثانية من التفاعل.

يتم تحديد خصوصية ركيزة الفوسفوليبيد في مقايسة Lnt بناء على التحول الحركي لببتيد N-acyl diacylglyceryl على نسبة عالية من Tris-Tricine Urea SDS-PAGE4. كانت الفوسفوليبيدات ذات مجموعات الرأس القطبية الصغيرة ، المشبعة [sn-1] وغير المشبعة [sn-2] ، ركائز مفضلة 4. مقايسة إزاحة الهلام ليست مناسبة للدراسات الحركية المكثفة للبروتين الشحمي N-acyltransferase ولا ل HTS لتحديد الجزيئات المثبطة. تم استخدام كيمياء النقر باستخدام أحماض الألكين الدهنية بنجاح لدراسة تعديل البروتين الدهني في البكتيريا5 واستقلاب الأحماض الدهنية في حقيقيات النوى6. في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن مقايسة في المختبر من رأس palmitoylation لتحديد مثبطات7.

في الطريقة الموضحة هنا ، يتم تحضين Lnt النشط المنقى في المنظفات مع ركائز في مذيلات مختلطة لتشكيل الببتيد ثلاثي الأسيل الألكاين الذي يتم اكتشافه لاحقا بواسطة مطياف التألق.

Protocol

1. إعداد الانزيم والركيزة تنقية الانزيم إنتاج وتنقية إنزيم Lnt من الأغشية القابلة للذوبان في المنظفات كما هو موضح سابقا 4,8. باختصار ، حث التعبير عن جين lnt-strep ، وترميز Lnt بعلامة Strep C-terminal ، عند OD600 من 0.6 مع التتراسيكلين اللامائي (200 نا…

Representative Results

في تفاعل Lnt ، يتم نقل الأحماض الدهنية sn-1 من الدهون الفوسفاتية إلى ببتيد ثنائي الغليسيريل ، مما ينتج عنه ببتيد ثلاثي الأسيلناضج 8. تم تصميم مقايسة Lnt في المختبر الموصوفة هنا لاستخدام الدهون الفوسفاتية التي تحتوي على حمض دهني ألكين (ألكين-POPE) و FSL-1-بيوتين كركائز ، مما يؤدي إلى…

Discussion

بروتوكول اختبار Lnt الموصوف هنا ، بناء على الكشف عن مضان المنتج ثلاثي الأسيل ، حساس وقابل للتكرار. يعد الارتباط المحدد والفعال للبيوتين بالستربتافيدين عنصرا أساسيا في الفحص. يتم أيضا تمييز ركيزة Alkyne-POPE المتبقية بعد الانتهاء من تفاعل Lnt بالفلورسنت باستخدام FAM ولكن يتم إزالتها بكفاءة بعد الا?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر فابريس أغو وأليكس بوشارلات من منصة الفحص الكيميائي والبيولوجي ، مركز الموارد التكنولوجية والبحوث (C2RT) في معهد باستور باريس على الاقتراحات المفيدة حول البروتوكول ، وجميع أعضاء وحدة BGPB على الدعم والمناقشات العلمية ، وسيمون ليجود على القراءة النقدية للمخطوطة. تم تمويل العمل من قبل مبادرات الرعاية العالمية لمعهد كارنو للأمراض المعدية ومعهد كارنو للميكروبات والصحة (15 CARN 0017-01 و 16 CARN 0023-01).

Materials

Äkta Purifier FPLC system GE Healthcare NA Purity: NA
Lnt purification
alkyne-POPE Avanti Polar Lipids 900414P Purity: >99%
Lnt substrate
Azido-FAM Lumiprobe A4130 Purity: 100% (pure)
Click reagent
BioPhotometer Plus Eppendorf N/A Purity: NA
OD 600 nm
BioTek ELX 405 Select plate washer BioTek N° serie 115800, n° materiel 405 Select Purity: NA
Wash steps
biotin-fluorescein Sigma 53608 Purity: ≥90%
Fluorescence control
Copper(II) sulfate pentahydrate Sigma C3036 Purity: ≥98%
Click reagent
DDM Anatrace D310A Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α
Detergent for Lnt purification
Dimethylsulfoxide (DMSO) Invitrogen D12435 Purity: anhydrous
Solbilization Click reagent
Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL INTEGRA 4721 Purity: NA
Handling reagents
French Pressure Cell N/A N/A Purity: NA
Cell disruption
FSL-1-biotin EMC microcollections L7030 Purity: NA
Lnt substrate
Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate Greiner 781091 Purity: NA
Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding Greiner 655097 Purity: NA
Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Microplate reader Infinite M1000 pro Tecan N/A Purity: NA
Fluorescence detection
MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) Anatrace S110MT Purity: ~100%
Thiol specific inhibitor
Optically Clear Adhesive Seal Sheets Thermo Scientific AB-1170 Purity: NA
Foil to seal multi-well plate
Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column GE Healthcare GE28-9356-04 Purity: NA
Lnt purification
StrepTactin Sepharose 50 % IBA Biotechnology 2-1201-010 Purity: NA
Lnt purification
streptavidin Sigma S4762-1MG Purity: ≥13 units/mg protein
Biotin binding
TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine Sigma 678937 Purity: 97%
Click reagent
TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma 75259 Purity: ≥98%
Click reagent
TECAN Infinite F500 Tecan N/A Purity: NA
Fluorescence detection
TECAN Infinite M1000 pro Tecan N/A Purity: NA
Fluorescence detection
Thermomixer C Eppendorf 5382000015 Purity: NA
Heated lid
Triton X-100 Sigma 93443 Purity: 10% in H2O
Lnt reaction buffer
Ultra centrifuge Beckman LC N/A Purity: NA
Cell fractionation

References

  1. Buddelmeijer, N. The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification–how, when and why. FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).
  2. Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).
  3. Jackowski, S., Rock, C. O. Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).
  4. Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).
  5. Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters. Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).
  6. Thiele, C., et al. Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry. ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).
  7. Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation. Science Reports. 7, 41147 (2017).
  8. Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). Science Reports. 9 (1), 15978 (2019).
  9. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  10. Mao, G., et al. Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase. Nature Communication. 7, 10198 (2016).
  11. Vogeley, L., et al. Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin. Science. 351 (6275), 876-880 (2016).
  12. Wiktor, M., et al. Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis. Nature Communication. 8, 15952 (2017).
  13. Noland, C. L., et al. Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).
  14. Lu, G., et al. Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase. Nature Communication. 8, 15948 (2017).

Play Video

Cite This Article
Nozeret, K., Pernin, A., Buddelmeijer, N. Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening. J. Vis. Exp. (159), e61146, doi:10.3791/61146 (2020).

View Video