Summary

Op klikchemie gebaseerde fluorometrische test voor Apolipoproteïne N-acyltransferase van enzymkarakterisering naar screening met hoge doorvoer

Published: May 13, 2020
doi:

Summary

Hier wordt een gevoelige fluorescentietest gepresenteerd om de Apolipoproteïne N-acyltransferase-activiteit te volgen met behulp van diacylglycerylpeptide en alkynfolipiden als substraten met klikchemie.

Abstract

Lipoproteïnen uit proteobacteriën worden posttranslationeel gemodificeerd door vetzuren afgeleid van membraanfosfolipiden door de werking van drie integrale membraanenzymen, wat resulteert in getriacyleerde eiwitten. De eerste stap in de lipoproteïnemodificatieroute omvat de overdracht van een diacylglycerylgroep van fosfatidylglycerol naar het prolipoproteïne, wat resulteert in diacylglycerylprolipoproteïne. In de tweede stap wordt het signaalpeptide van prolipoproteïne gesplitst en vormt het een apolipoproteïne, dat op zijn beurt wordt gewijzigd door een derde vetzuur afgeleid van een fosfolipide. Deze laatste stap wordt gekatalyseerd door apolipoproteïne N-acyltransferase (Lnt). De lipoproteïnemodificatieroute is essentieel in de meeste γ-proteobacteriën, waardoor het een potentieel doelwit is voor de ontwikkeling van nieuwe antibacteriële middelen. Hier wordt een gevoelige test voor Lnt beschreven die compatibel is met high-throughput screening van kleine remmende moleculen. Het enzym en de substraten zijn membraan-ingebedde moleculen; daarom is de ontwikkeling van een in vitro test niet eenvoudig. Dit omvat de zuivering van het actieve enzym in aanwezigheid van wasmiddel, de beschikbaarheid van alkynfosfolipiden en diacylglycerylpeptidesubstraten en de reactieomstandigheden in gemengde micellen. Om de activiteitstest te gebruiken in een high-throughput screening (HTS) opstelling, heeft directe uitlezing van het reactieproduct bovendien de voorkeur boven gekoppelde enzymatische reacties. In deze fluorometrische enzymtest wordt het alkyn-getriagyleerde peptideproduct fluorescerend gemaakt door een klikchemiereactie en gedetecteerd in een multiwell-plaatformaat. Deze methode is van toepassing op andere acyltransferasen die vetzuurhoudende substraten gebruiken, waaronder fosfolipiden en acyl-CoA.

Introduction

Bacteriële lipoproteïnen worden gekenmerkt door covalent gebonden vetzuren op hun amino-termini waardoor ze worden verankerd in membranen 1,2. Het volwassen deel van het eiwit is zeer divers in structuur en functie, waardoor de rol van lipoproteïnen in verschillende biologische processen in de bacteriële celenvelop wordt verklaard.

Lipoproteïnen worden gemodificeerd door fosfolipide-afgeleide vetzuren na inbrenging in het cytoplasmamembraan. De prolipoproteïnen bevatten een kenmerkend motief, de lipobox, die een invariant cysteïneresidu bevat dat wordt geacyleerd en het eerste aminozuur in het rijpe eiwit. De eerste stap van deze route wordt gekatalyseerd door prolipoproteïnefosfatidylglycerol::d iacylglyceryltransferase (Lgt), dat de diacylglycerylgroep overbrengt van fosfatidylglycerol naar het prolipoproteïne via een thioetherverbinding tussen diacylglyceryl en cysteïne. Signaal peptidase II (Lsp) splitst het signaalpeptide van diacylglyceryl prolipoproteïne, wat resulteert in een apolipoproteïne dat via zijn diacylglycerylgroep in het membraan is verankerd. De derde en laatste stap wordt gekatalyseerd door apolipoproteïne N-acyltransferase (Lnt), dat een vetzuur uit de sn-1-positie van fosfolipide toevoegt aan apolipoproteïne, wat resulteert in getriacyleerd rijp lipoproteïne (figuur 1)3. De Lnt-reactie is een pingpongreactie in twee stappen waarbij een stabiel thioester-acyl-enzymtussenproduct wordt gevormd. Het bijproduct van lysofosfolipide wordt vrijgegeven voorafgaand aan de acylering van het apolipoproteïnesubstraat in de tweede stap van de reactie.

De specificiteit van het fosfolipidensubstraat wordt bepaald in een Lnt-test op basis van de mobiliteitsverschuiving van N-acyldiacylglycerylpeptide op een hoog percentage Tris-Tricine Urea SDS-PAGE4. Fosfolipiden met kleine polaire kopgroepen, verzadigd [sn-1] en niet-verzadigd [sn-2], hadden de voorkeur als substraten4. De gelverschuivingstest is niet geschikt voor uitgebreide kinetische studies van apolipoproteïne N-acyltransferase, noch voor HTS om remmende moleculen te identificeren. Klikchemie met behulp van alkynvetzuren is met succes gebruikt om lipoproteïnemodificatie in bacteriën5 en vetzuurmetabolisme in eukaryoten6 te bestuderen. Onlangs werd een in vitro test van Ras-palmitoylering gemeld om remmers te identificeren7.

In de hier beschreven methode wordt gezuiverde actieve Lnt in wasmiddel geïncubeerd met substraten in gemengde micellen om alkyn-getristacyleerd peptide te vormen dat vervolgens wordt gedetecteerd door fluorescentiespectrometrie.

Protocol

1. Enzym- en substraatvoorbereiding Zuivering van enzym Produceren en zuiveren van Lnt-enzym uit wasmiddel opgeloste membranen zoals eerder beschreven 4,8. In het kort, induceer expressie van het lnt-strep-gen, coderend voor Lnt met een C-terminal Strep-tag, bij OD600 van 0,6 met watervrij tetracycline (200 ng/ml) bij 37 °C gedurende 16 uur. Oogst cellen door centrifugeren bij 4.000 x g …

Representative Results

In de Lnt-reactie wordt het sn-1 vetzuur uit fosfolipiden overgebracht op een diacylglycerylpeptide, wat resulteert in volwassen getrianacyleerd peptide8. De hier beschreven in vitro Lnt-test is ontworpen om fosfolipiden met een alkynvetzuur (alkyn-POPE) en FSL-1-biotine als substraten te gebruiken, wat resulteert in de vorming van alkyn-FSL-1-biotine. Bij een klikchemiereactie met azido-FAM moet dit product fluorescerend worden gelabeld en gedetecteerd door fluorescentiespectrometrie (<s…

Discussion

Het hier beschreven protocol voor de Lnt-test, gebaseerd op fluorescentiedetectie van het getriagyleerde product, is gevoelig en reproduceerbaar. De specifieke en efficiënte binding van biotine aan streptavidin is een belangrijk element in de test. Het alkyne-POPE-substraat dat overblijft na voltooiing van de Lnt-reactie wordt ook fluorescerend gelabeld met FAM, maar wordt efficiënt verwijderd na binding aan de streptavidinplaten door meerdere wasstappen. Bovendien heeft toevoeging van DMSO geen invloed op de Lnt-activ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We bedanken Fabrice Agou en Alix Boucharlat van het Chemogenomic and Biological Screening Platform, Center for Technological Resources and Research (C2RT) van Institut Pasteur Paris voor nuttige suggesties over het protocol, alle leden van de BGPB-eenheid voor ondersteuning en wetenschappelijke discussies, en Simon Legood voor het kritisch lezen van het manuscript. Het werk werd gefinancierd door Global Care Initiatives van het Institute Carnot Infectious diseases en het Institute Carnot Microbes and Health (15 CARN 0017-01 en 16 CARN 0023-01).

Materials

Äkta Purifier FPLC system GE Healthcare NA Purity: NA
Lnt purification
alkyne-POPE Avanti Polar Lipids 900414P Purity: >99%
Lnt substrate
Azido-FAM Lumiprobe A4130 Purity: 100% (pure)
Click reagent
BioPhotometer Plus Eppendorf N/A Purity: NA
OD 600 nm
BioTek ELX 405 Select plate washer BioTek N° serie 115800, n° materiel 405 Select Purity: NA
Wash steps
biotin-fluorescein Sigma 53608 Purity: ≥90%
Fluorescence control
Copper(II) sulfate pentahydrate Sigma C3036 Purity: ≥98%
Click reagent
DDM Anatrace D310A Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α
Detergent for Lnt purification
Dimethylsulfoxide (DMSO) Invitrogen D12435 Purity: anhydrous
Solbilization Click reagent
Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL INTEGRA 4721 Purity: NA
Handling reagents
French Pressure Cell N/A N/A Purity: NA
Cell disruption
FSL-1-biotin EMC microcollections L7030 Purity: NA
Lnt substrate
Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate Greiner 781091 Purity: NA
Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding Greiner 655097 Purity: NA
Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Microplate reader Infinite M1000 pro Tecan N/A Purity: NA
Fluorescence detection
MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) Anatrace S110MT Purity: ~100%
Thiol specific inhibitor
Optically Clear Adhesive Seal Sheets Thermo Scientific AB-1170 Purity: NA
Foil to seal multi-well plate
Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column GE Healthcare GE28-9356-04 Purity: NA
Lnt purification
StrepTactin Sepharose 50 % IBA Biotechnology 2-1201-010 Purity: NA
Lnt purification
streptavidin Sigma S4762-1MG Purity: ≥13 units/mg protein
Biotin binding
TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine Sigma 678937 Purity: 97%
Click reagent
TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma 75259 Purity: ≥98%
Click reagent
TECAN Infinite F500 Tecan N/A Purity: NA
Fluorescence detection
TECAN Infinite M1000 pro Tecan N/A Purity: NA
Fluorescence detection
Thermomixer C Eppendorf 5382000015 Purity: NA
Heated lid
Triton X-100 Sigma 93443 Purity: 10% in H2O
Lnt reaction buffer
Ultra centrifuge Beckman LC N/A Purity: NA
Cell fractionation

References

  1. Buddelmeijer, N. The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification–how, when and why. FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).
  2. Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).
  3. Jackowski, S., Rock, C. O. Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).
  4. Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).
  5. Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters. Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).
  6. Thiele, C., et al. Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry. ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).
  7. Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation. Science Reports. 7, 41147 (2017).
  8. Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). Science Reports. 9 (1), 15978 (2019).
  9. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  10. Mao, G., et al. Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase. Nature Communication. 7, 10198 (2016).
  11. Vogeley, L., et al. Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin. Science. 351 (6275), 876-880 (2016).
  12. Wiktor, M., et al. Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis. Nature Communication. 8, 15952 (2017).
  13. Noland, C. L., et al. Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).
  14. Lu, G., et al. Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase. Nature Communication. 8, 15948 (2017).

Play Video

Cite This Article
Nozeret, K., Pernin, A., Buddelmeijer, N. Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening. J. Vis. Exp. (159), e61146, doi:10.3791/61146 (2020).

View Video