Monitoring influenzavirusoverleving buiten de gastheer met behulp van real-time celanalyse
Summary
Hier is een protocol gerapporteerd voor de kwantificering van infectieuze virale deeltjes met behulp van real-time monitoring van elektrische impedantie van geïnfecteerde cellen. Een praktische toepassing van deze methode wordt gepresenteerd door het kwantificeren van influenza A-virusverval onder verschillende fysisch-chemische parameters die omgevingsomstandigheden nabootsen.
Abstract
Methoden voor het kwantificeren van virusdeeltjes vormen een cruciaal aspect van veel virologische studies. Hoewel er verschillende betrouwbare technieken bestaan, zijn ze tijdrovend of niet in staat om kleine variaties te detecteren. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de nauwkeurige kwantificering van virale titer door elektrische impedantievariaties van geïnfecteerde cellen in realtime te analyseren. Cellulaire impedantie wordt gemeten door middel van gouden micro-elektrode biosensoren onder de cellen in microplaten, waarbij de grootte afhangt van het aantal cellen en hun grootte en vorm. Dit protocol maakt real-time analyse van celproliferatie, levensvatbaarheid, morfologie en migratie mogelijk met verbeterde gevoeligheid. Ook wordt een voorbeeld gegeven van een praktische toepassing door het kwantificeren van het verval van influenza A-virus (IAV) onderworpen aan verschillende fysisch-chemische parameters die de virale infectiviteit in de loop van de tijd beïnvloeden (d.w.z. temperatuur, zoutgehalte en pH). Voor dergelijke toepassingen vermindert het protocol de benodigde werklast en genereert het ook nauwkeurige kwantificeringsgegevens van infectieuze virusdeeltjes. Het maakt de vergelijking van inactiveringshellingen tussen verschillende IAV’s mogelijk, wat hun vermogen weerspiegelt om in een bepaalde omgeving te blijven bestaan. Dit protocol is gemakkelijk uit te voeren, is zeer reproduceerbaar en kan worden toegepast op elk virus dat cytopathische effecten in celkweek produceert.
Introduction
De overdracht van een virus is afhankelijk van de combinatie van verschillende factoren. Voor een virus dat in de omgeving wordt uitgescheiden, hangt de overdracht ervan ook af van het vermogen om te volharden in omstandigheden buiten de gastheer. Het bestuderen van virale inactivatie in het algemeen is daarom een cruciale stap in het helpen van nationale gezondheidsautoriteiten en beleidsmakers bij het implementeren van controle- en bioveiligheidsmaatregelen.
De kennis over de persistentie van virussen in natuurlijke en laboratoriumomgevingen is de afgelopen tien jaar aanzienlijk toegenomen. In het geval van influenza A-virussen (IAV) onderwerpen hun transmissieroutes virale deeltjes aan een breed scala aan omgevingsomstandigheden. In het bijzonder kunnen ze worden overgedragen via 1) fecaal-orale routes door water (d.w.z. vogelvirussen), of 2) direct of indirect contact door besmette fomites, evenals aerosolen en ademhalingsdruppels (d.w.z. pluimvee- en zoogdiervirussen)1. In elk geval worden IAV onderworpen aan verschillende fysisch-chemische parameters (d.w.z. pH, zoutgehalte, temperatuur en vochtigheid), die min of meer snel hun infectiviteit beïnvloeden2,3,4,5,6,7,8,9. Het is van groot belang, met name met betrekking tot zoönotische en pandemische virussen, om het potentieel van omgevingsfactoren te beoordelen om de virusdynamiek en de risico’s van blootstelling en overdracht tussen soorten te beïnvloeden.
Tot nu toe zijn traditionele virologische technieken (d.w.z. virale titerbepaling door middel van plaquetests of 50% weefselkweek infectieuze dosisschatting) gebruikt om de IAV-infectiviteit in de loop van de tijd te beoordelen; maar deze technieken zijn tijdrovend en vereisen veel benodigdheden10,11,12. Het meten van de impedantie van geïnfecteerde cellen in de loop van de tijd met micro-elektroden dient als een nuttig hulpmiddel om de IAV-overleving in verschillende omgevingsomstandigheden te volgen, evenals virale inactivatie in het algemeen. Deze methode biedt objectieve, real-time gegevens die subjectieve menselijke observatie van cytopathische effecten vervangen. Het kan worden gebruikt om virustitratie te bepalen, waardoor traditionele metingen worden vervangen door lagere betrouwbaarheidsintervallen en arbeidsintensieve eindpunttests worden vermeden.
Er bestaat een lineaire correlatie tussen titratieresultaten verkregen door meting van celimpedantie en door klassieke plaquetest of TCID50-methoden. Daarom kunnen gegevens verkregen met de op impedantie gebaseerde titratiemethode eenvoudig worden omgezet in TCID50– of pfu-waarden door een standaardcurve te maken met seriële verdunning van het virus13,14,15,16,17. Detectie, kwantificering en werkzaamheid van neutraliserende antilichamen in serummonsters kunnen ook worden bereikt met behulp van deze experimentele benadering18,19. Meer recent zijn op impedantie gebaseerde cellulaire assays gebruikt om antivirale verbindingen tegen Equid alphaherpesvirussen20 te screenen en te evalueren.
Deze technologie is gebruikt om de persistentie van IAV’s in zout water bij verschillende temperaturen te evalueren en om mutaties in het hemagglutinine van IAV te identificeren die de IAV-persistentie in de omgeving verhogen of verlagen21. Een dergelijke screening zou uitgebreid werk vereisen als traditionele titratiemethoden worden gebruikt. Deze methodologie kan echter worden gebruikt voor elk virus dat van invloed is op de celmorfologie, het celnummer en de hechtingssterkte van het celoppervlak. Het kan ook worden gebruikt om persistentie in verschillende omgevingsomstandigheden (d.w.z. in de lucht, in water of op oppervlakken) te controleren.
Het hier beschreven protocol past IAV-overleving in water toe als voorbeeld. Menselijke influenzavirussen worden gedurende langere perioden blootgesteld aan verschillende fysisch-chemische parameters. Zout water (35 g/L NaCl) bij 35 °C werd gekozen als milieumodel op basis van eerdere resultaten9. Resterende infectiviteit van blootgestelde virussen wordt gekwantificeerd op verschillende tijdstippen door celinfectie. MDCK-cellen, het referentieceltype voor IAV-amplificatie, worden gezaaid op 16 goed microtiterplaten bedekt met micro-elektrodesensoren en 24 uur later geïnfecteerd door blootgestelde virussen. Celimpedantie wordt elke 15 minuten gemeten en uitgedrukt als een willekeurige eenheid die de celindex (CI) wordt genoemd. Cytopathische effecten geïnduceerd door het influenzavirus, waarvan de snelheid van aanvang direct afhangt van het aantal infectieuze virale deeltjes dat in de celkweek wordt geënt, leidt tot CI-afname, die vervolgens wordt gekwantificeerd als de CIT50-waarde . Deze waarde komt overeen met de tijd die nodig is om een reductie van 50% ten opzichte van het initiële CI te meten (d.w.z. vóór virustoevoeging). CIT50-waarden berekend voor verschillende omgevingsblootstellingstijden maken het mogelijk om de inactiveringshelling van een virus af te trekken na lineaire regressie van CIT50-waarden .
Protocol
Representative Results
Discussion
RTCA is een op impedantie gebaseerde technologie die steeds vaker wordt gebruikt voor real-time monitoring van celeigenschappen, zoals celtrouw, proliferatie, migratie en cytotoxiciteit. In deze studie wordt het vermogen van deze technologie om de IAV-overleving buiten de gastheer te beoordelen aangetoond door de virusinactivatiehelling te meten. Kieskeurige technieken zoals TCID50 en plaque-assays worden vervangen door objectieve real-time beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen, waardoor cytopathisch…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| 0.25%Trypsin | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 plates) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-plates are avalible in different packaging |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate) |
References
- Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J. Routes of influenza transmission. Influenza and Other Respiratory Viruses. 7, 42-51 (2013).
- Sooryanarain, H., Elankumaran, S. Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks. Annual Review of Animal Biosciences. 3 (1), 347-373 (2015).
- Keeler, S. P., Dalton, M. S., Cressler, A. M., Berghaus, R. D., Stallknecht, D. E. Abiotic factors affecting the persistence of avian influenza virus in surface waters of waterfowl habitats. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2910-2917 (2014).
- Stallknecht, D. E., Kearney, M. T., Shane, S. M., Zwank, P. J. Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 34 (2), 412-418 (1990).
- Poulson, R. L., Tompkins, S. M., Berghaus, R. D., Brown, J. D., Stallknecht, D. E. Environmental Stability of Swine and Human Pandemic Influenza Viruses in Water under Variable Conditions of Temperature, Salinity, and pH. Applied and Environmental Microbiology. 82 (13), 3721-3726 (2016).
- Zhang, G., et al. Evidence of influenza A virus RNA in Siberian lake ice. Journal of Virology. 80 (24), 12229-12235 (2006).
- Nazir, J., et al. Long-Term Study on Tenacity of Avian Influenza Viruses in Water (Distilled Water, Normal Saline, and Surface Water) at Different Temperatures. Avian Diseases. 54 (1), 720-724 (2010).
- Brown, J. D., Swayne, D. E., Cooper, R. J., Burns, R. E., Stallknecht, D. E. Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 51, 285-289 (2007).
- Dublineau, A., et al. Persistence of the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus in water and on non-porous surface. PLoS ONE. 6 (11), 28043 (2011).
- Titration of Influenza Viruses. Springer Nature Experiments Available from: https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4 (2020)
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Influenza: Propagation, Quantification, and Storage. Current Protocols in Microbiology. 3 (1), 1-22 (2006).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells. Applied Microbiology. 16 (4), 588-594 (1968).
- Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (1), 37-41 (2010).
- Lebourgeois, S., et al. Development of a Real-Time Cell Analysis (RTCA) Method as a Fast and Accurate Method for Detecting Infectious Particles of the Adapted Strain of Hepatitis A Virus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 335 (2018).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis–a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
- Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. Journal of Virological Methods. 252, 57-64 (2018).
- Tian, D., et al. Real-Time Cell Analysis for Measuring Viral Cytopathogenesis and the Efficacy of Neutralizing Antibodies to the 2009 Influenza A (H1N1) Virus. PLoS ONE. 7 (2), 31965 (2012).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis–a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
- Labadie, T., Batéjat, C., Manuguerra, J. -. C., Leclercq, I. Influenza Virus Segment Composition Influences Viral Stability in the Environment. Frontiers in Microbiology. 9, 1496 (2018).
- Wiley, D. C., Skehel, J. J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Annual Review of Biochemistry. 56, 365-394 (1987).
