رصد بقاء فيروس الأنفلونزا خارج المضيف باستخدام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي
Summary
تم الإبلاغ هنا عن بروتوكول لقياس كمية الجسيمات الفيروسية المعدية باستخدام المراقبة في الوقت الفعلي للمعاوقة الكهربائية للخلايا المصابة. يتم تقديم تطبيق عملي لهذه الطريقة عن طريق تحديد مقدار تحلل فيروس الأنفلونزا A تحت معايير فيزيائية كيميائية مختلفة تحاكي الظروف البيئية.
Abstract
تمثل طرق قياس كمية جسيمات الفيروس جانبا حاسما في العديد من دراسات علم الفيروسات. على الرغم من وجود العديد من التقنيات الموثوقة ، إلا أنها إما تستغرق وقتا طويلا أو غير قادرة على اكتشاف الاختلافات الصغيرة. يظهر هنا بروتوكول لتحديد كمي دقيق للعيار الفيروسي من خلال تحليل اختلافات المعاوقة الكهربائية للخلايا المصابة في الوقت الفعلي. يتم قياس المعاوقة الخلوية من خلال أجهزة الاستشعار الحيوية للقطب الدقيق الذهبي الموجودة تحت الخلايا في الصفائح الدقيقة ، والتي يعتمد حجمها على عدد الخلايا وكذلك حجمها وشكلها. يسمح هذا البروتوكول بالتحليل في الوقت الفعلي لانتشار الخلايا وقابليتها للحياة والتشكل والهجرة مع حساسية محسنة. كما يقدم مثال على تطبيق عملي من خلال تحديد مقدار اضمحلال فيروس الأنفلونزا A (IAV) المقدم إلى مختلف المعلمات الفيزيائية والكيميائية التي تؤثر على العدوى الفيروسية بمرور الوقت (أي درجة الحرارة والملوحة ودرجة الحموضة). وبالنسبة لمثل هذه التطبيقات، يقلل البروتوكول من عبء العمل اللازم مع توليد بيانات كمية دقيقة لجسيمات الفيروسات المعدية. يسمح بمقارنة المنحدرات المعطلة بين مختلف IAV ، مما يعكس قدرتها على الاستمرار في بيئة معينة. هذا البروتوكول سهل التنفيذ ، وهو قابل للتكرار بشكل كبير ، ويمكن تطبيقه على أي فيروس ينتج تأثيرات cytopathic في زراعة الخلايا.
Introduction
يعتمد انتقال الفيروس على مزيج من عدة عوامل. بالنسبة للفيروس الذي يفرز في البيئة ، يعتمد انتقاله أيضا على القدرة على الاستمرار في ظروف خارج المضيف. ولذلك، فإن دراسة التعطيل الفيروسي بشكل عام هي خطوة حاسمة في مساعدة السلطات الصحية الوطنية وواضعي السياسات على تنفيذ تدابير المكافحة والسلامة الأحيائية.
زادت المعرفة حول استمرار الفيروس في البيئات الطبيعية والمختبرية بشكل كبير خلال العقد الماضي. وفي حالة فيروسات الأنفلونزا ألف، تخضع طرق انتقالها الجسيمات الفيروسية لمجموعة واسعة من الظروف البيئية. وعلى وجه التحديد، يمكن أن تنتقل عن طريق 1) الطرق البرازية الفموية عبر الماء (أي فيروسات الطيور)، أو 2) الاتصال المباشر أو غير المباشر عن طريق البؤر الملوثة، وكذلك الهباء الجوي وقطرات الجهاز التنفسي (أي فيروسات الدواجن والثدييات)1. على أي حال ، يتم تقديم IAV إلى مختلف المعلمات الفيزيائية والكيميائية (أي الرقم الهيدروجيني والملوحة ودرجة الحرارة والرطوبة) ، والتي تؤثر بسرعة إلى حد ما على عدواها 2،3،4،5،6،7،8،9. ومن الأهمية بمكان، لا سيما فيما يتعلق بالفيروسات الحيوانية المنشأ والفيروسات الوبائية، تقييم إمكانات العوامل البيئية في التأثير على ديناميات الفيروس ومخاطر التعرض له وانتقاله عبر الأنواع.
وحتى الآن، استخدمت تقنيات علم الفيروسات التقليدية (أي تحديد عيار الفيروس من خلال مقايسات اللويحات أو تقدير الجرعات المعدية لزراعة الأنسجة بنسبة 50 في المائة) لتقييم عدوى فيروس نقص المناعة البشرية بمرور الوقت؛ لكن هذه التقنيات تستغرق وقتا طويلا وتتطلب العديد من الإمدادات10،11،12. يعد قياس مقاومة الخلايا المصابة بمرور الوقت باستخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة بمثابة أداة مفيدة لمراقبة بقاء IAV في ظروف بيئية مختلفة ، وكذلك تعطيل الفيروس بشكل عام. توفر هذه الطريقة بيانات موضوعية في الوقت الفعلي تحل محل الملاحظة البشرية الذاتية لتأثيرات اعتلال الخلايا. ويمكن استخدامه لتحديد معايرة الفيروسات، وبالتالي استبدال القياسات التقليدية بفترات ثقة أقل وتجنب مقايسات نقاط النهاية كثيفة العمالة.
توجد علاقة خطية بين نتائج المعايرة بالتحليل الحجمي التي تم الحصول عليها عن طريق قياس مقاومة الخلايا وطرق فحص البلاك الكلاسيكية أو TCID50. لذلك ، يمكن تحويل البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة المعايرة بالتحليل الحجمي القائمة على المعاوقة بسهولة في قيم TCID50 أو pfu عن طريق إنشاء منحنى قياسي مع التخفيف التسلسلي للفيروس13،14،15،16،17. يمكن أيضا تحقيق الكشف عن الأجسام المضادة المحايدة الموجودة في عينات المصل وتحديدها كميا وفعاليتها باستخدام هذا النهج التجريبي18,19. وفي الآونة الأخيرة، تم استخدام الفحوصات الخلوية القائمة على المعاوقة لفحص وتقييم المركبات المضادة للفيروسات ضد فيروسات الهربس ألفا المكافئة20.
وقد استخدمت هذه التكنولوجيا لتقييم ثبات ال IAVs في المياه المالحة عند درجات حرارة مختلفة وتحديد الطفرات في الهيماجلوتينين من IAV التي تزيد أو تقلل من ثبات IAV في البيئة21. وسيتطلب هذا الفحص عملا مكثفا إذا ما استخدم أساليب المعايرة بالتحليل الحجمي التقليدية. ومع ذلك ، يمكن استخدام هذه المنهجية لأي فيروس له تأثير على مورفولوجيا الخلية ورقم الخلية وقوة ارتباط سطح الخلية. ويمكن أيضا أن تستخدم لمراقبة الثبات في مختلف الظروف البيئية (أي في الهواء أو في الماء أو على الأسطح).
البروتوكول الموصوف هنا يطبق بقاء IAV في الماء كمثال. تتعرض فيروسات الأنفلونزا البشرية لمعلمات فيزيائية كيميائية مختلفة خلال فترات طويلة. تم اختيار المياه المالحة (35 جم/لتر كلوريد الصوديوم) عند 35 درجة مئوية كنموذج بيئي بناء على النتائج السابقة9. يتم تحديد العدوى المتبقية للفيروسات المكشوفة كميا في نقاط زمنية مختلفة من خلال عدوى الخلايا. يتم زرع خلايا MDCK ، وهي نوع الخلية المرجعية لتضخيم IAV ، على 16 لوحة ميكروتيتر جيدة مغلفة بأجهزة استشعار microelectrode ومصابة بالفيروسات المكشوفة بعد 24 ساعة. يتم قياس مقاومة الخلية كل 15 دقيقة ويتم التعبير عنها كوحدة عشوائية تسمى مؤشر الخلية (CI). آثار اعتلال الخلايا التي يسببها فيروس الأنفلونزا ، الذي يعتمد معدل ظهوره بشكل مباشر على عدد الجسيمات الفيروسية المعدية التي تم تلقيحها إلى مزرعة الخلايا ، يؤدي إلى انخفاض CI ، والذي يتم تحديده لاحقا كميا على أنه قيمة CIT50. تتوافق هذه القيمة مع الوقت اللازم لقياس انخفاض بنسبة 50٪ من CI الأولي (أي قبل إضافة الفيروس). تسمح قيم CIT50 المحسوبة لعدة أوقات التعرض البيئي بخصم ميل تعطيل الفيروس بعد الانحدار الخطي لقيم CIT50.
Protocol
Representative Results
Discussion
RTCA هي تقنية قائمة على المعاوقة تستخدم بشكل متزايد لمراقبة خصائص الخلايا في الوقت الفعلي ، مثل التصاق الخلايا وانتشارها وهجرتها وسميتها الخلوية. في هذه الدراسة ، يتم إثبات قدرة هذه التكنولوجيا على تقييم بقاء IAV خارج المضيف من خلال قياس ميل تعطيل الفيروس. يتم استبدال التقنيات السريعة مثل <sub…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| 0.25%Trypsin | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 plates) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-plates are avalible in different packaging |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate) |
References
- Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J. Routes of influenza transmission. Influenza and Other Respiratory Viruses. 7, 42-51 (2013).
- Sooryanarain, H., Elankumaran, S. Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks. Annual Review of Animal Biosciences. 3 (1), 347-373 (2015).
- Keeler, S. P., Dalton, M. S., Cressler, A. M., Berghaus, R. D., Stallknecht, D. E. Abiotic factors affecting the persistence of avian influenza virus in surface waters of waterfowl habitats. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2910-2917 (2014).
- Stallknecht, D. E., Kearney, M. T., Shane, S. M., Zwank, P. J. Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 34 (2), 412-418 (1990).
- Poulson, R. L., Tompkins, S. M., Berghaus, R. D., Brown, J. D., Stallknecht, D. E. Environmental Stability of Swine and Human Pandemic Influenza Viruses in Water under Variable Conditions of Temperature, Salinity, and pH. Applied and Environmental Microbiology. 82 (13), 3721-3726 (2016).
- Zhang, G., et al. Evidence of influenza A virus RNA in Siberian lake ice. Journal of Virology. 80 (24), 12229-12235 (2006).
- Nazir, J., et al. Long-Term Study on Tenacity of Avian Influenza Viruses in Water (Distilled Water, Normal Saline, and Surface Water) at Different Temperatures. Avian Diseases. 54 (1), 720-724 (2010).
- Brown, J. D., Swayne, D. E., Cooper, R. J., Burns, R. E., Stallknecht, D. E. Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 51, 285-289 (2007).
- Dublineau, A., et al. Persistence of the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus in water and on non-porous surface. PLoS ONE. 6 (11), 28043 (2011).
- Titration of Influenza Viruses. Springer Nature Experiments Available from: https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4 (2020)
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Influenza: Propagation, Quantification, and Storage. Current Protocols in Microbiology. 3 (1), 1-22 (2006).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells. Applied Microbiology. 16 (4), 588-594 (1968).
- Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (1), 37-41 (2010).
- Lebourgeois, S., et al. Development of a Real-Time Cell Analysis (RTCA) Method as a Fast and Accurate Method for Detecting Infectious Particles of the Adapted Strain of Hepatitis A Virus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 335 (2018).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis–a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
- Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. Journal of Virological Methods. 252, 57-64 (2018).
- Tian, D., et al. Real-Time Cell Analysis for Measuring Viral Cytopathogenesis and the Efficacy of Neutralizing Antibodies to the 2009 Influenza A (H1N1) Virus. PLoS ONE. 7 (2), 31965 (2012).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis–a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
- Labadie, T., Batéjat, C., Manuguerra, J. -. C., Leclercq, I. Influenza Virus Segment Composition Influences Viral Stability in the Environment. Frontiers in Microbiology. 9, 1496 (2018).
- Wiley, D. C., Skehel, J. J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Annual Review of Biochemistry. 56, 365-394 (1987).
