Мониторинг выживаемости вируса гриппа вне хозяина с помощью анализа клеток в режиме реального времени

Передача вируса зависит от сочетания нескольких факторов. Для вируса, секретируемого в окружающей среде, его передача также зависит от способности сохраняться в условиях вне хозяина. Таким образом, изучение вирусной инактивации в целом является решающим шагом в оказании помощи национальным органам здравоохранения и лицам, формирующим политику, в осуществлении мер контроля и биобезопасности.

За последнее десятилетие значительно возросли знания о персистенции вируса в естественных и лабораторных условиях. В случае вирусов гриппа А (IAV) их пути передачи представляют вирусные частицы в широком диапазоне условий окружающей среды. В частности, они могут передаваться через 1) фекально-оральные пути через воду (т.е. птичьи вирусы) или 2) прямой или косвенный контакт зараженных фомитов, а также аэрозолей и респираторных капель (т.е. вирусов домашней птицы и млекопитающих)¹. В любом случае, IAV подвергаются различным физико-химическим параметрам (т.е. рН, солености, температуре и влажности), что более или менее быстро влияет на их инфекционность2,3,4,5,6,7,8,9. Очень важно, особенно в отношении зоонозных и пандемических вирусов, оценить потенциал факторов окружающей среды, влияющих на динамику вируса, и риски воздействия и межвидовой передачи.

До настоящего времени для оценки инфекционной активности IAV с течением времени использовались традиционные методы вирусологии (т.е. определение титра вируса с помощью анализов бляшек или 50% оценка инфекционной дозы культуры тканей); но эти методы отнимают много времени и требуют многих расходных материалов10,11,12. Измерение импеданса инфицированных клеток с течением времени с помощью микроэлектродов служит полезным инструментом для мониторинга выживаемости IAV в различных условиях окружающей среды, а также вирусной инактивации в целом. Этот метод предоставляет объективные данные в режиме реального времени, которые заменяют субъективное наблюдение человека за цитопатическими эффектами. Его можно использовать для определения титрования вируса, тем самым заменяя традиционные измерения более низкими доверительными интервалами и избегая трудоемких анализов конечных точек.

Существует линейная корреляция между результатами титрования, полученными путем измерения импеданса клеток, и классическим анализом бляшек или методами _TCID50. Поэтому данные, полученные методом титрования на основе импеданса, могут быть легко преобразованы в значения _TCID50 или pfu путем создания стандартной кривой с последовательным разбавлением вируса13,14,15,16,17. Обнаружение, количественная оценка и эффективность нейтрализующих антител, присутствующих в образцах сыворотки, также могут быть достигнуты с использованием этого экспериментального ^{подхода18,19}. Совсем недавно клеточные анализы на основе импеданса использовались для скрининга и оценки противовирусных соединений против альфагерпесвирусов ^Equid20.

Эта технология была использована для оценки стойкости IAV в соленой воде при различных температурах и для выявления мутаций в гемагглютинине IAV, которые увеличивают или уменьшают стойкость IAV в окружающей ^среде21. Такой скрининг потребует обширной работы при использовании традиционных методов титрования. Однако эта методология может быть использована для любого вируса, который оказывает влияние на морфологию клеток, количество клеток и силу прикрепления клеточной поверхности. Он также может быть использован для мониторинга стойкости в различных условиях окружающей среды (например, в воздухе, в воде или на поверхностях).

Протокол, описанный здесь, применяет выживание IAV в воде в качестве примера. Вирусы гриппа человека подвергаются воздействию различных физико-химических показателей в течение длительных периодов времени. Соленая (35 г/л NaCl) вода при 35 °C была выбрана в качестве экологической модели на основе предыдущих ^{результатов9}. Остаточная инфекционность подвергшихся воздействию вирусов количественно определяется в разные моменты времени через клеточную инфекцию. Клетки MDCK, тип эталонных клеток для амплификации IAV, засеивают на 16 микротитрных пластинах, покрытых микроэлектродными датчиками, и заражаются облученными вирусами через 24 ч. Импеданс клеток измеряется каждые 15 мин и выражается в виде произвольной единицы, называемой клеточным индексом (CI). Цитопатические эффекты, индуцированные вирусом гриппа, скорость начала которого напрямую зависит от количества инфекционных вирусных частиц, привитых культуре клеток, приводит к снижению ДИ, которое впоследствии количественно определяется как значение _CIT50 . Это значение соответствует времени, необходимому для измерения снижения на 50% от исходного ДИ (т.е. до добавления вируса). Значения _CIT50 , рассчитанные на несколько раз воздействия на окружающую среду, позволяют вывести наклон инактивации вируса после линейной регрессии значений _CIT50 .