Monitoraggio della sopravvivenza del virus influenzale al di fuori dell'ospite utilizzando l'analisi cellulare in tempo reale

La trasmissione di un virus si basa sulla combinazione di diversi fattori. Per un virus secreto nell’ambiente, la sua trasmissione dipende anche dalla capacità di persistere in condizioni al di fuori dell’ospite. Studiare l’inattivazione virale in generale è, quindi, un passo cruciale per aiutare le autorità sanitarie nazionali e i responsabili politici ad attuare misure di controllo e biosicurezza.

La conoscenza della persistenza del virus in ambienti naturali e di laboratorio è aumentata considerevolmente nell’ultimo decennio. Nel caso dei virus dell’influenza A (IAV), le loro vie di trasmissione sottopongono le particelle virali a una vasta gamma di condizioni ambientali. In particolare, possono essere trasmessi attraverso 1) vie fecali-orali attraverso l’acqua (cioè virus aviari), o 2) contatto diretto o indiretto da fomiti contaminati, nonché aerosol e goccioline respiratorie (cioè virus di pollame e mammiferi)¹. In ogni caso, gli IAV sono sottoposti a vari parametri fisico-chimici (pH, salinità, temperatura e umidità), che influenzano più o meno rapidamente la loro infettività2,3,4,5,6,7,8,9. È di grande importanza, soprattutto per quanto riguarda i virus zoonotici e pandemici, valutare il potenziale dei fattori ambientali di influenzare le dinamiche virali e i rischi di esposizione e trasmissione tra specie.

Finora, le tecniche di virologia tradizionali (ad esempio, la determinazione del titolo virale attraverso saggi di placca o la stima della dose infettiva della coltura tissutale al 50%) sono state utilizzate per valutare l’infettività IAV nel tempo; ma queste tecniche richiedono molto tempo e richiedono molte forniture10,11,12. Misurare l’impedenza delle cellule infette nel tempo con microelettrodi serve come strumento utile per monitorare la sopravvivenza dello IAV in diverse condizioni ambientali, così come l’inattivazione virale in generale. Questo metodo fornisce dati oggettivi e in tempo reale che sostituiscono l’osservazione umana soggettiva degli effetti citopatici. Può essere utilizzato per determinare la titolazione del virus, sostituendo così le misurazioni tradizionali con intervalli di confidenza più bassi ed evitando test finali ad alta intensità di lavoro.

Esiste una correlazione lineare tra i risultati della titolazione ottenuti mediante misurazione dell’impedenza cellulare e mediante il saggio classico della placca o i metodi _TCID50. Pertanto, i dati ottenuti con il metodo di titolazione basato sull’impedenza possono essere facilmente trasformati in valori _TCID50 o pfu creando una curva standard con diluizione seriale del virus13,14,15,16,17. Anche il rilevamento, la quantificazione e l’efficacia degli anticorpi neutralizzanti presenti nei campioni di siero possono essere raggiunti utilizzando questo approccio ^{sperimentale18,19}. Più recentemente, sono stati utilizzati saggi cellulari basati sull’impedenza per lo screening e la valutazione di composti antivirali contro gli alfaherpesvirus ^Equid20.

Questa tecnologia è stata utilizzata per valutare la persistenza degli IAV in acqua salina a diverse temperature e per identificare mutazioni nell’emoagglutinina di IAV che aumentano o diminuiscono la persistenza IAV ^{nell’ambiente21}. Tale screening richiederebbe un ampio lavoro se si utilizzano metodi di titolazione tradizionali. Tuttavia, questa metodologia può essere utilizzata per qualsiasi virus che abbia un impatto sulla morfologia cellulare, sul numero di cellule e sulla forza di attaccamento della superficie cellulare. Può anche essere utilizzato per monitorare la persistenza in varie condizioni ambientali (ad esempio, nell’aria, nell’acqua o sulle superfici).

Il protocollo qui descritto applica la sopravvivenza IAV in acqua come esempio. I virus dell’influenza umana sono esposti a diversi parametri fisico-chimici durante periodi prolungati. L’acqua salina (35 g/L NaCl) a 35 °C è stata scelta come modello ambientale sulla base dei risultati ^precedenti9. L’infettività residua dei virus esposti è quantificata in diversi punti temporali attraverso l’infezione cellulare. Le cellule MDCK, il tipo di cellula di riferimento per l’amplificazione IAV, vengono seminate su piastre di microtitolazione a 16 pozzetti rivestite con sensori a microelettrodi e infettate da virus esposti 24 ore dopo. L’impedenza cellulare viene misurata ogni 15 minuti ed espressa come un’unità arbitraria chiamata indice cellulare (CI). Gli effetti citopatici indotti dal virus dell’influenza, il cui tasso di insorgenza dipende direttamente dal numero di particelle virali infettive inoculate nella coltura cellulare, portano alla diminuzione dell’IC, che viene successivamente quantificata come valore _CIT50 . Questo valore corrisponde al tempo necessario per misurare una riduzione del 50% dall’IC iniziale (cioè prima dell’aggiunta del virus). I valori _CIT50 calcolati per diversi tempi di esposizione ambientale consentono di dedurre la pendenza di inattivazione di un virus dopo la regressione lineare dei valori _CIT50 .