Bu makalede, tek veya toplu C. elegans örneklerinde gen ekspresyon seviyelerinin hızlı ve güvenilir bir şekilde belirlenmesi için yüksek aktarım hızı protokolü açıklanmıştır. Bu protokol RNA yalıtımı gerektirmez ve doğrudan örneklerden cDNA üretir. Yüksek verimli çok katlı nanoakışkan gerçek zamanlı qPCR platformları ile birlikte kullanılabilir.
Bu makale, caenorhabditis elegans için hızlı, sağlam ve son derece hassas olan yüksek verimli ters transkripsiyon nicel PCR (RT-qPCR) testini sürmektedir. Bu protokol, tek solucanlardan veya toplu örneklerden gen ekspresyonunun hassas ölçümlerini elde eder. Burada sunulan protokol, nanoakışkan rt-qPCR platformuna bağlı olarak tamamlayıcı DNA (cDNA) hazırlama için mevcut yöntemlerin yeni bir uyarlamasını sağlar. ‘Worm-to-CT’ adı verilen bu protokolün ilk bölümü, önceden mRNA izolasyonu gerek kalmadan doğrudan nematodlardan cDNA üretimine izin verir. 3,5 saat içinde 96 solucandan cDNA hazırlanmasına izin vererek deneysel verimi arttırır. Protokolün ikinci bölümü, cDNA’da yüksek verimli RT-qPCR çalıştırmak için mevcut nanoakışkan teknolojiyi kullanır. Bu makale iki farklı nanoakışkan çipi değerlendirir: ilki 96 örnek ve 96 hedef çalıştırır ve yaklaşık 1,5 günlük tezgah çalışmasında 9.216 reaksiyonla sonuçlanır. İkinci yonga türü altı 12 x 12 diziden oluşur ve 864 reaksiyonla sonuçlanır. Burada, Worm-to-CT yöntemi, tek solucanlardan ve toplu örneklerden ısı şok proteinlerini kodlayan genlerin mRNA seviyelerinin ölçülmesi ile gösterilmiştir. Sağlanan, C. elegans genomunda kodlanan genlerin çoğu için işlenmiş RNA’yı güçlendirmek için tasarlanmış astarların geniş bir listesidir.
Tek hücreli RNA diziliminin ve qPCR’nin optimizasyonu, transkripsiyonel darbelerin veya patlamaların hücre başına RNA moleküllerinin sayısında büyük farklılıklara yol açabileceğini ortaya koydu1. Ayrıca, bu teknolojiler daha önce standart toplu transkriptomik ölçümler tarafından kaçırılan önemli hücresel heterojenliği ortaya çıkardı. Bağlama bağlı olarak, bazı tek hücreli transkripsiyonal değişkenlik dokuların karışık hücresel bileşimden kaynaklanır. Bununla birlikte, aynı ortamda yetişen izojenik hücre popülasyonlarında bile yaygın transkripsiyonal heterojenlikvardır 2,3. Bu ‘biyolojik değişkenlik’, bakterilerden insana kadar hücresel ağların her yerde bulunan bir özelliği olarak giderek daha fazla tanımlanmaktadır. Bazı durumlarda, gelişim, kanser ilerlemesi, HIV gecikmesi ve kemoterapiye yanıtta fenotipik sonuçlar doğurabilir4,5.
Nematod Caenorhabditis elegans, bireyler arasındaki biyolojik değişkenliğin nedenlerini ve sonuçlarını incelemek için ideal özelliklere sahip benzersiz bir model organizmadır. Bu nematodlar 959 hücreden oluşan basit bir model organizmadır ve şeffaf lütikülleri onları in vivo görüntüleme çalışmaları için uygun hale getirir6. C. elegans, ağırlıklı olarak kendi kendini dölleme yoluyla üreyen hermafroditik bir türdür; bu izojenik laboratuvar suşları ile sonuçlandı. İzojenikliğe ve kontrollü kültür koşullarına rağmen, birçok fenotip ve transkript bireyler arasında değişkendir, bu da stokastik veya mikroçevronmental farklılıkların bireyler arasında heterojenliğe katkıda bulunduğunu göstermektedir7,8. Gen ekspresyonunda bu tür değişkenlik, mutasyonların penetrancesinde değişkenlik, sağkalım, gelişimsel zamanlama ve doğurganlık 7,8 ,9dahil olmak üzere birden fazla fitness sonucuna sahiptir. Bu özellikler nedeniyle, tek solucan çalışmaları tüm bir organizmada biyolojik değişkenliği incelemek için eşi görülmemiş bir fırsat sağlar.
Transkriptlerin tek solucan düzeyinde doğru tespiti için teknolojilerin geliştirilmesi ve optimize edilmesi için sahada temel bir ihtiyaç vardır. Tek solucanlı RNA dizilimi10,izole dokulardan RNA dizilimi11ve tek hücreli sıralama12 gibi yeni teknolojiler artık C. elegansiçin kullanılabilir. Bununla birlikte, ana bir zorluk devam etmektedir: interindividuality izlerken, zayıf ifade edilen genler genellikle tespit edilebilir seviyelerin altına düşer13. Bu, özellikle küçük miktarlardaki başlangıç malzemesinden izole edilmiş nadir transkriptler için geçerlidir, çünkü ortalama ifade ve teknik varyans arasında köklü, ters bir ilişki vardır ve genellikle nadir transkriptlerin istatistiksel kesintilerin altına düşmesine neden olur13. Yüksek verimli çok katlı qPCR teknolojilerinin optimizasyonu, özellikle nadir transkriptlerin ekspresyonunu incelerken memeli tek hücreli çalışmalar için yararlı olduğu kanıtlanmıştır14,15. Bu teknoloji, diğer tek solucan teknolojilerinin kıyaslama ve doğrulama amaçları için de kullanılabilir.
Solucandan BT’ye, hücre biyolojisi çalışmalarında kullanılan bir kitten, tek solucanlı cDNA hazırlama için uyarlanmış hızlı ve sağlam bir yöntemdir. Bu yöntemle elde edilen cDNA, çok katlı nanoakışkan qPCR teknolojisi ile birleştiğinde, daha yüksek deneysel aktarım hızı, daha geniş bir dinamik algılama aralığı sağladığı ve tek hücreli amaçlar için doğrulandığı için seçilmiştir14,15. Açıklanan cDNA hazırlığı standart PCR teknolojileriyle kullanım için de geçerlidir. Verim iki şekilde artırılır: İlk olarak, cDNA hazırlığı geleneksel guanidium tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyondan daha hızlı ve daha güvenilirdir, çünkü solucanlar doğrudan lizis tamponuna eklenir ve kolayca bozulabilir RNA’nın doğrudan izolasyonunu atlar. İkincisi, nanoakışkan teknolojilerin kullanılması, aynı anda çalıştırılabilen numune ve hedef sayısını önemli ölçüde artırır. Bu makalede, iki yonga karşılaştırılmıştır: tek dizili bir çip ve çok dizili bir çip. Tek dizili bir çip, 96 tek solucan ve 96 astar seti çalıştırabilir ve bu da deney başına 9.216 reaksiyona neden olur. Standart qPCR teknolojilerini kullanarak benzer bir aktarım hızı elde etmek için 96 kuyu plakası kullanarak 96 ayrı qPCR denemesi gerekir. Daha küçük ve daha esnek çok dizili yonga, 864 reaksiyonla sonuçlanan altı 12 x 12 diziden oluşur. Yöntemin üstün güvenilirliği ve duyarlılığı nanoakışkan teknoloji ve bir önamplifikasyon adımının devreye girmesiyle artırılmıştır. Bu makalede sunulan yöntem, biyolojik varyansı çıkarmak için son teknoloji istatistiksel algoritma ile birlikte kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Bu makalede, hem tek solucan hem de toplu solucan örnekleri için hızlı cDNA hazırlama ve yüksek verimli qPCR protokolü sunulmaktadır; algoritma başka bir yerde yayınlanacaktır. Bu protokol için, her çipin organizasyonu deneyden önce hazırlanmalıdır. Tablo 1 ve Tablo 2, sırasıyla çok dizili ve tek dizili yonga için bu planların örneklerini gösterir. Şekil 1’de ayrıntılı olarak açıklanan ve Şekil 2’deçok dizili ve tek dizili yongaları çalıştıran Solucandan CT’ye protokolüne genel bakışlar da vardır.
Bu yazıda, Worm-to-CT protokolünün, RNA’yı tek solucanlardan veya küçük bir solucan havuzundan çıkarmak için hızlı ve verimli bir yöntem olduğu gösterilmiştir. Nanoakışkan sistemin sunduğu yüksek verim, onu bireyler arası değişkenlik ölçümlerinin ölçülmesi için ideal hale getirir. Ayrıca, bu yöntemin yüksek duyarlılığı, tek solucanlı RNA-seq teknolojileri9kullanırken algılamanın altına düşen düşük seviyelerde ifade edilen genlerin algılanmasını sağlar.
Tek solucanlardan cDNA hazırlamak için yöntem seçimini düşünürken. Ly ve ark.29, kütikül sindirimi için proteinaz K’ye dayanan bir protokolü optimize etti. Manikül, moleküllerin solucanlardan izolesi için büyük bir engeldir ve proteinaz K onu kırmak için etkili bir yöntem sağlar. Bununla birlikte, proteinaz K’nin ters transkripsiyon için enzim kullanabilmesi için ısı inaktive edilmesi gerekir. Ly ve arkadaşları 96 °C’ye 10 dk maruz kalma kullanırken, RNA kolayca bozulabilir olduğu için bu protokolde bu adımdan kaçınılmıştır. Kütikülün kırılması için proteinaz K kullanmak yerine tekrarlanan donma-çözülme döngüleri kullanılmıştır. Donma-çözülme, kütikülleri kırmak için etkili bir yöntemdir, çünkü solucan başına daha fazla RNA izole edilebilir. Ly ve ark. solucan başına çıkarılan toplam RNA’nın proteinaz K kullanılarak 35 ng olduğunu bildirirken, bu protokol solucan başına 51,75 ng ± toplam RNA 6,74 SEM elde eder. Önamplifikasyon adımlarıyla birlikte ısıya maruz kalmanın önlenmesi, görünüşe göre Worm-to-CT’nin dinamik algılama aralığını standart protokollere kıyasla genişletiyor. Ly ve ark. ısı şoku sonrası hsp-70 için hsp-16.2 ve 22.8 ± 0.17 için 21.1 ± 0.15 mutlak Ct değerlerini bildirin. Aynı ısı şoku koşullarını (30 °C’de 1 saat) kullanan bu protokol, hsp-16.2 için 17.93 ± 0.57 ve hsp-70 için 21.13 ±0.33 mutlak Ct değerleri elde eder. Bu, dondurarak çözülme liziz yönteminin daha yüksek RNA verimi sağladığını ve düşük eksprese transkriptler için daha uygun olduğunu gösterir.
Nanoakışkan sistemler, belirli bir hedef transkript kümesini ve deneyin ölçeğine adaptasyona izin veren daha küçük (çok dizili çip) veya daha büyük (tek dizili çip) sayıda numunenin kullanımını araştırırken idealdir. Tek bir solucanda ifade edilen tüm transkriptlerin tarafsız bir resmini elde etmek için, bariz seçim RNA dizilimini kullanmaktır. Bununla birlikte, deneyin odak noktası daha küçük ama yine de nispeten büyük bir hedef gen kümesi ise, araştırmacının bir nanoakışkan PCR makinesine erişimi olması koşuluyla bu protokolü kullanmak daha uygun maliyetlidir. Nanoakışkan sistem reaktiflerinin ve tek dizili çipin maliyeti solucan başına yaklaşık 13 £ olarak tahmin edilirken, tek solucan dizilimi için reaktiflerin maliyetleri, sıralama maliyetleri dahil olmak üzere solucan başına yaklaşık 60 £ olacaktır.
Hangi PCR platformunun kullanılacağı düşünüldüğünde, nanoakışkan qPCR ile birleştirilen Worm-to-CT yöntemi zaman ve aktarım hızı açısından avantajlar sunar. Yaklaşık 2 günlük çalışmada 9.216 RT-qPCR sonucu elde etmek mümkündür, ancak standart bir qPCR platformu kullanarak aynı sayıda hedefin amplifikasyonu, günde dört plaka çalıştıran 96 kuyu plakası tahlilleri kullanılarak yaklaşık 5 çalışma haftası sürer. Ancak, test edilecek hedef sayısı daha küçükse, standart bir qPCR makinesiyle birlikte Worm-to-CT kullanmak daha uygun maliyetlidir. Tek dizili yongalar yeniden çalıştırılamaz, bu nedenle boş kuyuların çalıştırılması maliyet verimliliğini azaltır.
Yöntemin bir sınırlaması, çoklama adımı sırasında astar-primer dimerlerin potansiyel oluşumudur, ancak bu vakaların% 1’inden daha azında gerçekleşir. Solucandan CT’ye protokol verimli olmasına ve tek solucanlara uygulandığında güvenilir sonuçlar sağlamasına rağmen, yaklaşık% 5’lik bir arıza oranı vardır, bu da solucanın hasat adımı sırasında kapakta veya tüpün üstünde sıkışıp kaldığı durumlara karşılık gelir.
Birlikte, bu çok yönlü ve güvenilir yöntem, daha standart tekniklere kıyasla daha yüksek verim ve hassasiyet sunar. Bu yöntem, yüksek verimli ekranların doğrulanması için çok yararlı olabilir ve tek solucan gen ifade düzeylerini izlemek veya doğrulamak için mükemmel bir seçimdir. Bu yöntem, izole dokulardan gen ekspresyonunun niceliği gibi diğer zorlu tekniklere uygulanabilir. Örneğin, bağırsak, gonadlar veya CBC’ler tarafından izole edilen hücreler gibi tam dokuların izolasyonu, RNA dizileme deneyleri yapmak için yeterli malzeme sağlar. Bununla birlikte, sınırlı miktarda malzeme genellikle nadir transkriptlerin nicelliğini önleyen yinelenen okumalara yol açar. Bu senaryoda, nanoakışkan tabanlı teknolojinin kullanılması, araştırmacıların bu dokulardaki veya hücrelerdeki tüm transkriptlerin yalnızca bir alt kümesini izlemeleri gerekiyorsa, deneylere ek duyarlılık sağlamalı ve maliyet verimliliğini artırmalıdır.
The authors have nothing to disclose.
Sharlene Murdoch’a ve Babraham Enstitüsü Tesisleri’ne destekleri için teşekkür ederiz. JLP Wellcome Trust (093970/Z/10/Z) ve OC ERC 638426 ve BBSRC [BBS/E/B000C0426] tarafından desteklenmiştir.
100µM stock primers for genes of interest. | |||
20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | for 96.96 chip (Single-Array Chip) |
2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | 100-7611 | |
384 well plates | |||
8-strip PCR tubes | |||
96 well ice block | |||
96 well plates | |||
96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M-96.96 | Referenced throughout the manuscript as "Single-Array Chip" |
96-well sealing tape | |||
BioMark & EP1 Software | Fluidigm | 101-6793 | Contains: Biomark HD Data Collection software, Real-Time PCR Analysis software, SNP Genotyping Analysis software, Digital PCR Analysis software, Melt Curve Analysis software |
BioMark or BioMark HD system | Fluidigm | 100-2451 K1 | Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics thermocycler" |
Control Line Fluid Kit for 96.96 and FlexSix IFCs | Fluidigm | 89000021 | Referenced throughout manuscript as "control line fluid" |
DNA Suspension buffer | TEKnova | T0021 | |
domed PCR caps | |||
Exonuclease I | New England BioLabs | M0293L | |
Exonuclease I reaction buffer | New England BioLabs | B0293S | |
FLEXsix DELTAgene Sample Reagent | Fluidigm | 100-7673 | referenced throughout manuscript as "sample reagent" |
FLEXsix Gene Expression IFC | Fluidigm | 100-6308 | referenced throughout manuscript as "Multi-Array Chip" |
Fluidigm Real-Time PCR Analysis User Guide | Fluidigm | 68000088 | This is the protocol used as a basis for section 2 of the protocol, referenced within the manuscript. |
IFC Controller MX | Fluidigm | 68000112 I1 | Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics PCR priming machine" |
IFC Controllers SOFTWEAR | Fluidigm | 100-2297 | Contains all softwear and scripts required for running the IFC controller MX |
liquid nitrogen in dewar | |||
Microcentrifuge | StarLab | C1301B-230V | Used to spin down PCR tube strips in the protocol. |
Nuclease Free Water | |||
plate spinner | Labnet | K4050725 | mini plate spinner, mps 1000. referenced through the protocol as "tabletop plate spinner" |
Power SYBR Green Cells-to-Ct kit | invitrogen | 4402955 | This kit is that which is adapted for use in nematodes in the Worm-to-CT protocol. Contense: Store Stop Solution, DNase I and 20X RT Enzyme Mix at -20°C. Store Lysis Solution, 2X SYBR RT Buffer (referenced throughout the manuscript as RT buffer), and Power SYBR®Green PCR Master Mix (refferenced througout the manuscript as PCR Master Mix). This Kit is for 400 reactions, kits also available for 40 and 100 reactions. |
PreAmp Master Mix | Fluidigm | 100-5580, 100-5581 | |
Reverse Transcription Master Mix—480 reactions | Fluidigm | 100-6299 | One tube also available for 96 reactions (PN100-6298) |
Rnase Free water | |||
SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX | Bio-Rad Laboratories | 172-5211 | referenced throughout the manuscript as "fluorescent probe supermix" |
Standard 96 and 384-well Thermal Cycler | |||
TE Buffer (10mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTA | TEKnova | T0224 | Referenced throughout the manuscript as Tris-EDTA buffer |
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000031 | Referenced throughout the text as "thermal mixer" |
Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | Referenced through the protocol as "guanidium thiocyanate-phenol-chloroform" |
Warm water bath |