ナノ流体技術を用いた単一およびバルク C.エレガンス サンプルにおける高スループット定量RT-PCR

注: このプロトコルを通して 、カエノハブディティス・エレガンス は「ワーム」または「ワーム」と呼ばれます。 様々なC.エレガン株 は、オンラインデータベースを介して、またはモデル生物を使用するラボに直接連絡することによって注文することができます。このプロトコルのパートI(セクション1-3)では、ワームからCTへのプロトコルを介したcDNAの準備について説明します。このプロトコルのパート II (セクション 4-13) は、Fluidigm16によって開発されたプロトコルから適応した、ナノ流体を使用して高スループット RT-qPCR を実行する方法を説明します。このプロトコルは、先に定義された2種類のナノ流体チップ、96個のターゲットを96サンプル(合計9,216 RT-qPCR反応)に監視できるシングルアレイチップ、または12ターゲットx12サンプルのサブユニットとして機能するマルチアレイチップの使用に適用されます。すべてのマルチアレイチップには、6つの独立したアレイが含まれています。たとえば、マルチアレイチップ全体を使用すると、72個のターゲットx 12サンプル(またはその逆)、または36ターゲットx 24サンプル(またはその逆)を監視できます。このプロトコルで使用される材料の詳細については、 資料表を参照してください。 1. RT-qPCR プライマー検証 注意:リアルタイムプライマーは、当初MIQUEガイドライン17によって発行された推奨プロパティに基づいて設計されました。処理されたRNAに特異的なプライマーを作るために、製品は、少なくとも1つのスプライス接合の両側に結合した2つのプライマーになるように設計した。適切なプライマーの要件には、グアニンおよびシトシン含量20%、融解温度58-60°C、プライマー対≤0.5°Cの融解温度の差、70~120bpの製品長が含まれていました。生成されるプライマーの配列は 補足表 1に記載されています。プライマーの生成に使用するスクリプトのオープンソースコードは、https://github.com/s-andrews/wormrtpcr にあります。スプライスサイトを持つトランスクリプト用のプライマーペアは、イントロンに隣接する2つのエキソンに横たわるように設計されたが、NCBIプライマーブラストソフトウェア18を使用して、スプライスバリアント特異的になるように設計されていない。この研究では、プライマーセットを C.エレガンス ゲノムに対して爆破し、オフターゲットの相補性をテストした。 RT-qPCRプライマーのデータベースからプライマーを取り出す(補足表1)。あるいは、NCBI プライマー ブラスト18などのオンライン ツールを使用して qPCR プライマー ペアを設計します。 qPCR 標準曲線を実行して、標準バルク qPCR 技術19および MIQUE ガイドライン17,20に従ってプライマーの各ペアの特異性と PCR 効率をモニタリングします。注: R2 > 0.98 のプライマー ペアと PCR 効率は 85~ 115% の場合にのみ使用してください。この研究で使用したプライマーの配列、PCR効率、およびR2 について、 表3に詳述する。 2. ワームからCTへのワームリシス 細菌の芝生から新鮮な種なしのNGMプレートにワームを選び、ワームがその動きを通してワームから細菌のほとんどを取り除くために5分間プレートの周りを移動できるようにします。注:細菌の芝生と成長条件は、実験計画によって異なります。ここで発表された実験では、OP50 大腸菌 を播種した6cmのNGMプレートが必要であり、20°CインキュベーターでL4.9のステージに成長した目的のワームが含まれる。 RNaseフリーフードでは、12.5 μLの2x RTバッファ、1.25 μLの20倍RT酵素バッファー、および1サンプル当たり0.25 μLのヌクレアーゼフリー水からなるマスターミックスを準備します。ステップ2.8から各サンプルの11 μLに14 μLのマスターミックスを加えます。 PCRストリップの蓋を逆さまにして、分解スコープのプラットフォームに置き、化合物顕微鏡下のドーム型PCRチューブキャップに10μLのリシスミックスを加えます。注: サンプルが 1 つか 2 つしかない場合は、キャップが開く可能性が減るため、少なくとも 4 つのチューブを含む PCR ストリップを使用することをおし、その後のフリーズ融解のステップで開きます。あるいは、ゴムバンドを使用してキャップを所定の位置に保持することができます。その場合、チューブが移動するたびにキャップが適切に閉じられていることを確認します。 細菌汚染を避けるために、ライシスミックスを含む蓋の各スロットにワームを「すくい」(すなわち、ピックで下のワームを捕まえる)で、プレートからワームを選びます。チューブを閉じ、テーブルトップマイクロ遠心分離機(材料表)を使用して5s回転してから、液体窒素を充填したデュワーフラスコに入れてください。注: 15 ~ 30 個のワームは、一括実験に使用し、1 つのワームを測定する場合は 1 つのワームを使用する必要があります。注意:液体窒素を取り扱う場合は、皮膚や目との接触が深刻な凍傷を引き起こす可能性があるため、Cryo-手袋と保護アイウェアを着用し、標準的な衣類規制に準拠しています。 PCRチューブを液体窒素と~40°Cの水浴との間で転写して10倍凍結解凍します。サンプルが完全に凍結していることを確認するために、液体窒素にチューブを最低5 s放置します。サンプルが解凍されるまで、チューブを水浴中に残します。RNA分解につながるため、長期間放置しないでください。注:サンプルが約-200°Cに凍結され、RNAの分解を減らすので、チューブは液体窒素に長期間放置することができます。しかし、液体窒素が急速に蒸発するため、これはプロトコル停止点であってはなりません。 サーマルミキサー(材料表)でサンプルを混合し、4°Cに設定し、20~30分回転して~1,800rpmで回転させます。 サンプルが混合されている間、氷の上で停止溶液を解凍します。 テーブルトップのマイクロ遠心分離機(材料表)を使用してサンプルをスピンダウンし、各チューブに1μLのストップ溶液を追加します。注:サンプルはRNAを逆転写する前に、-80°Cで最大1週間放置することができます(セクション3)。 3. 逆転写 注:単一ワームの逆転写については、ここに示す結果は、ナノ流体チップを備えた試薬を使用して生成されました( 図1のオプション2)。 図1 のオプション2で強調された試薬は、プールされたサンプルの逆転写にも使用されました。どちらの方法も、さまざまなサンプルタイプで同じ意味で動作します。 単一ワームの逆転写 RNaseフリーフードで、1.25 μLの逆転写ミックス(材料表)を新しいPCRチューブに加えます。注:多くのサンプルがある場合は、96ウェルPCRプレートと自動ピペットを使用することができます。メーカーのプロトコルには、1つのサンプルあたり1 μLが使用できると書かれています。 溶解液を5μLとし、ステップ2.8から溶液ミックスを停止し、逆転写ミックスを含む新鮮なPCRチューブに添加します。注:メーカーのプロトコルでは、1 μLのRNA(2.5 pg/μL~250 ng/μL)を反応ごとに使用できると定めています。1プレート当たりの負のRT制御は、逆転写ミックスを5μLのlysedサンプルと1.25 μLのRNAAseフリー水に置き換えることによって追加できます。 サーボサイクラーで逆転写プログラムを使用してサンプルを実行します:25°Cは5分間、42°Cは30分、85°Cは5分、∞は4°Cです。注:生成されたcDNAは、高スループットのqPCRを使用して増幅およびデータ収集に進む前に-20°Cで保存することができます。 バルク サンプルの逆転写 (15-30 ワーム) RNaseフリーフードでは、12.5 μLの2x RTバッファ、1.25 μLの20倍RT酵素バッファー、および1サンプル当たり0.25 μLのヌクレアーゼフリー水からなるマスターミックスを準備します。11 μLの溶解溶液に14 μLのマスターミックスを加え、ステップ2.8から溶液ミックスを停止します。注:多数のサンプルを扱う場合、これは96ウェルプレートで行うことができます。 次の逆転写プログラムを使用してサーモサイクラーを介してサンプルを実行します: 37 °C 60 分, 5 分の 95 °C, ∞の場合は 4 °C. 製造したcDNA 1:4をヌクレアーゼを含まない水で希釈します。注:一般的に、製品は25 μLの最終容積に来て、その場合は75 μLを追加する必要があります。しかし、凝縮のために、最終的な体積は変化する可能性があります。したがって、最終的な溶液で1:4の比率を作るように調整してください。この希釈手順は、単一ワームに対して qPCR を実行する場合には適用されません。生成されたcDNAは、高スループットのqPCRを使用して増幅およびデータ収集に進む前に-20°Cで保存することができます。 4. マルチプレックスプライマーミックスの準備 50 μM 最終濃度のプライマーの各ペアに対して、フォワード/リバース(F/R)プライマーストックを準備します。同じボリュームの順方向プライマーとリバースプライマーをそれぞれ100 μMに混ぜます。 テストするプライマーペアごとに、50 μM F/R プライマーストックの 1 μL を組み合わせます。DNA懸濁液バッファーを合計容量100 μLまで追加します。注:ここでのストックプライマー濃度は、メーカーのプロトコル16に記載されているものとは異なりますが、同じ最終濃度の500 nMを保持します。 5. ターゲット特定の予備増幅 1 μLのプリアンプ化マスターミックス(材料表)、プールプライマーミックスの0.5 μL(ステップ4.2)、および10%の全体余剰体積を含む反応ごとに2.25μLのヌクレアーゼフリー水を含むマスターミックスを準備します。 96ウェルプレートでは、マスターのアリコート3.75 μLが、サンプル数の実行に必要な数のウェルに混入します。 ステップ3.1.3または3.2.3で生成された目的のcDNA溶液の1.25 μLを各ウェルに追加します。 プレートを96ウェルシーリングテープ、短い渦、遠心分離機で卓上プレートスピナーで覆います。サーモサイクラーに移し、次のプログラムを実行します:2分間95°C、15sの95°Cで15サイクル、60°Cでアニーリング/延長4分、∞4°C。注:メーカーは、プリアンプリフェケーション反応16のために10〜20サイクルから推奨しています。このプロトコルは、標的遺伝子の発現レベルに応じて10サイクルまたは15サイクルを推奨する。 6. エキソヌクレアーゼI治療 注: これは、未組み込みのプライマーを予備化から除去する方法です。 エキソヌクレアーゼIの0.2 μLのエキソヌクレアスI反応バッファー(材料表)、エキソヌクレアーゼIの0.4 μLを20 U/μL(材料表)、1サンプル当たり1.4μLのヌクレアーゼフリー水で調製します。氷の上にすべての試薬、特にエキソヌクレアーゼIを保管してください。 96ウェルプレート(ステップ5.4)をサーモサイクラーから取り出し、卓上プレートスピナーで遠心分離機を取り出し、シールを慎重に取り外します。各プレアンプ化反応に2μLのエキソヌクレアーゼをミックスする。再シール、遠心分離機、および次のプログラムを使用してサーボサイクラーに96ウェルプレートを戻します:30分間37°C、15分間80°C、∞の場合は4°C。 サーモサイクラーからサンプルを取り出し、1x Tris EDTAバッファ(材料表)の18 μLを加えて1:5を希釈します。メモ:cDNAサンプルは-20°Cに保ち、後で使用することができます。メーカーのプロトコルは、対象となるターゲットの発現レベルに応じて、この段階16で5倍、10倍、または20倍の希釈の可能性を示唆しています。 7. アッセイミックスの準備 注:アッセイミックスは、ウェルがナノ流体チップと同じ間隔を持ち、読み込みが容易になるため、384ウェルプレートで調製できます。 マルチアレイチップ用アッセイミックスの準備 2xアッセイローディング試薬2μL(材料表)と1.6μLのDNA懸濁液緩衝液(材料表)からなるマスターミックスを、準備計画に従って各ウェルに用意します。このマスターミックスのアリコート3.6 μLは、384ウェルプレートに分かれています。 ステップ4.1で準備した50μM F/Rプライマーストックの0.4 μLを、準備された計画に従って適切なウェルに追加します。注:これは1 μLの余剰と、井戸ごとのアッセイミックスの合計4 μLを提供します。 シングル・アレイ・チップ用のアッセイ・ミックスの準備 調製計画に従って、3μLの2xアッセイローディング試薬と2.4μLのDNA懸濁液バッファーからなるマスターミックスを準備します。このマスターミックスのアリコート5.4 μLは、マークされた384ウェルプレートに十分に混ぜます。 準備された計画に従って、50 μM F/R プライマーストックの 0.6 μL を適切なウェルに追加します。注:これは1つの井戸ごとのアッセイミックスの合計6 μLを提供し、1 μLの余剰を提供します。 8. サンプルミックスの準備 注:サンプルミックスは、事前に1日まで調製し、4°Cで保存することができます。 マルチアレイチップのサンプルの準備 2x蛍光プローブスーパーミックス2μLのサンプルマスターミックスを調製し、低ROX(材料表)、サンプル試薬0.2μL(材料表)をサンプルあたりご用意ください。このミックスの2.2 μLをマークされた384ウェルプレートに分配します。注:メーカーは、サンプル試薬16をボルテックスしないことをお勧めします。 ピペット1.8μLの各プリアンプ化されたエキソヌクレアーゼは、ステップ3.2.3から適切なウェルにサンプルを処理した。注:合計4 μLで、余剰は1μLです。 シングル・アレイ・チップ用サンプルの準備 低ROX(材料表)を用いた3μLの蛍光プローブスーパーミックスと、サンプルあたり20倍のDNA結合染料サンプルローディング試薬(表)の0.3 μLからなるサンプルマスターミックスを準備します。このミックスの3.3 μLをマークされた384ウェルプレートに分配します。 ピペット2.7μLの各プリアンプとエキソヌクレアーゼは、ステップ6.3から適切なウェルにサンプルを処理し、準備された計画に従って。注:合計6 μLで、余剰は1μLです。サンプルなしで実行するウェルがある場合、これらはcDNAの代わりにサンプルマスターミックスと2.7 μLの水をロードする必要があります。これは両方のチップタイプに推奨されます。チップのグリッドを検出するために、機械はすべての入口に低いROXを必要とします。 9. ナノ流体チップのプライミング 注: マルチアレイチップは、初回実行時にのみプライミングする必要があります。同じチップの後続の実行がある場合、このステージはスキップできます。これらの手順は、両方のチップタイプで同じです。 ゆっくりと慎重に、含まれているシリンジから制御ライン流体の完全な150 μLをチップのアキュムレータに注入します。45°の角度でチップを保持し、シリンジの先端を押さえて、こぼれを避けて、制御液体がチップに触れないようにします。 チップの底面から青い保護フィルムを取り外します。 チップをナノ流体 PCR プライミングマシン (材料表) に挿入し、バーコードを外側に向けます。15~20 分かかる’Prime (153x)’ スクリプトを実行します。メモ:この段階でナノ流体サーモサイクラー(材料表)をオンにします。 10. ナノ流体チップのロード ロードが行われると、バリアプラグを順番に取り外します。これにより、井戸の誤ロードの可能性が低くなります。 マルチアレイチップに3μL、または各プライマーアッセイのシングルアレイチップに5μLを転送し、調製した計画に従ってナノ流体チップの対応する入口にサンプルミックスを行います。バブルを導入しないようにしてください。注:プライマーなしで実行される井戸がある場合は、プライマーのボリュームを水に置き換えて、マスターミックスをロードすることが重要です。これは両方のチップタイプに適用されます。この段階では、チップを暗い表面に置くのが簡単になり、井戸がより簡単に見えるようにすることができます。 11. ナノ流体チップの実行 注: マルチアレイ チップを初めて実行する場合は、[ ツール] を選択してトラッキング ファイルを設定| Flex Six Usage Trackingをクリックし、[ 新規] をクリックしてファイル名を入力し、場所を選択してから [完了] をクリックします。 データ収集ソフトウェアを開きます。[ 新しい実行の開始] をクリックします。バーコードを外側に向けてナノ流体サーモサイクラーに取り込んだチップを置きます。 必要に応じてプロジェクト設定を選択し、[ 次へ ]をクリック| 読み込み。マルチアレイチップをロードする場合は、実行するパーティション(アレイ)を選択します。 アプリケーションの [参照プローブ] を選択し、アプリケーションの種類を [遺伝子表現] に変更し、パッシブ参照を [ROX]に変更します。 [単一プローブアッセイ] を選択し、プローブタイプを Eva Greenに変更して、[ 次へ] をクリックします。 マルチアレイ チップを実行する熱サイクル プロトコル GE FLEX 6 Fast PCR+Melt v1 を選択するか、シングルアレイ チップを実行するプロトコル GE 96.96 Fast PCR+Melt v2 を選択します。 [自動露出]が選択されていることを確認し、[ファイル名を指定して実行を開始] をクリックします。 12. ポストチップラン 注:このセクションは、チップ全体を使用しない場合にのみ、マルチアレイチップに必要です。 ナノ流体サーモサイクラーからチップを取り出し、ナノ流体PCRプライミングマシンにロードし、5分続くポストラン(153x)スクリプトを実行します。 個人参照に使用するプラグにラベルを付けます。注:チップは室温で保存でき、チップ上の残りのアレイは2ヶ月以内に実行できます。 13. データのクリーンアップと分析 データを開くには、 “リアルタイム PCR 解析” ソフトウェア (材料表) を参照してください。テストしたすべてのプライマーペアの融解ピーク温度を確認します。所定のプライマー対に対して、複数の融解温度ピークを示す結果を排除する。注:複数のピークは、プライマーペアがダイマーを形成するとき、またはプールされたプライマーミックス内の他のプライマーとのターゲットプライマーの相互作用から、時折しか現れません。 データを「ヒートマップ」スプレッドシートファイルとしてエクスポートし、失敗したサンプルやプライマーを排除します。 標準のデルタCt法21を使用してデータを分析します。統計的評価のために、相対式レベルで一方向の分散分析を行う。