In dit artikel wordt een protocol met hoge doorvoer beschreven voor een snelle en betrouwbare bepaling van de genexpressieniveaus in enkele of bulk C. elegansmonsters. Dit protocol vereist geen RNA-isolatie en produceert cDNA rechtstreeks uit monsters. Het kan worden gebruikt samen met high-throughput multiplexed nanofluidic real-time qPCR platforms.
Dit artikel presenteert een high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) test voor Caenorhabditis elegans die snel, robuust en zeer gevoelig is. Dit protocol verkrijgt nauwkeurige metingen van genexpressie uit enkele wormen of uit bulkmonsters. Het hier gepresenteerde protocol biedt een nieuwe aanpassing van bestaande methoden voor complementaire DNA (cDNA) voorbereiding gekoppeld aan een nanofluïdisch RT-qPCR platform. Het eerste deel van dit protocol, genaamd ‘Worm-to-CT’, maakt cDNA-productie rechtstreeks uit nematoden mogelijk zonder voorafgaande mRNA-isolatie. Het verhoogt de experimentele doorvoer door de bereiding van cDNA van 96 wormen in 3,5 uur toe te staan. Het tweede deel van het protocol maakt gebruik van bestaande nanofluïdische technologie om RT-qPCR met hoge doorvoer op de cDNA uit te voeren. Dit artikel evalueert twee verschillende nanofluïdische chips: de eerste voert 96 monsters en 96 doelen uit, wat resulteert in 9.216 reacties in ongeveer 1,5 dag benchwork. Het tweede chiptype bestaat uit zes arrays van 12 x 12, wat resulteert in 864 reacties. Hier wordt de Worm-to-CT-methode aangetoond door mRNA-niveaus van genen te kwantificeren die coderen voor hitteschokeiwitten uit enkele wormen en uit bulkmonsters. Provided is een uitgebreide lijst van primers die zijn ontworpen om verwerkt RNA te versterken voor de meerderheid van de codeergenen binnen het C. elegans-genoom.
De optimalisatie van eencellige RNA-sequencing en qPCR onthulde dat transcriptiepulsen of bursts kunnen leiden tot enorme variatie in het aantal RNA-moleculen per cel1. Verder ontdekten deze technologieën aanzienlijke cellulaire heterogeniteit die eerder werd gemist door standaard bulktranomic metingen. Afhankelijk van de context wordt enige eencellige transcriptionele variabiliteit veroorzaakt door gemengde cellulaire samenstelling van weefsels. Zelfs in isogene celpopulaties die onder dezelfde omgeving worden gekweekt, is er echter wijdverspreide transcriptie heterogeniteit2,3. Deze ‘biologische variabiliteit’ wordt steeds meer geïdentificeerd als een alomtegenwoordige eigenschap van cellulaire netwerken, van bacteriën tot de mens. In sommige gevallen kan het fenotypische gevolgen hebben in de ontwikkeling, kankerprogressie, HIV-latentie en respons op chemotherapie4,5.
De nematode Caenorhabditis elegans is een uniek modelorganisme met ideale kenmerken voor het bestuderen van de oorzaken en gevolgen van biologische variabiliteit tussen individuen. Deze nematoden zijn een eenvoudig modelorganisme dat bestaat uit 959 cellen, en hun transparante nagelriem maakt ze vatbaar voor in vivo beeldvormingsstudies6. C. elegans is een hermafrodietsoort die zich voornamelijk voortplant door zelfbevruchting; dit resulteerde in isogene laboratoriumstammen. Ondanks isogeniciteit en gecontroleerde kweekomstandigheden zijn veel fenotypen en transcripties variabel tussen individuen, wat suggereert dat stochastische of micromilieuverschillen bijdragen aan heterogeniteit bij individuen7,8. Een dergelijke variabiliteit in genexpressie heeft meerdere fitnessgevolgen, waaronder variabiliteit in de penetrantie van mutaties, overleving, ontwikkelingstiming en vruchtbaarheid7,8,9. Vanwege deze kenmerken bieden studies met één worm de ongekende mogelijkheid om biologische variabiliteit in een heel organisme te bestuderen.
Er is een fundamentele behoefte in het veld om technologieën te ontwikkelen en te optimaliseren voor nauwkeurige detectie van transcripties op één wormniveau. Nieuwe technologieën, zoals single-worm RNA sequencing10, RNA sequencing uit geïsoleerde weefsels11, en eencellige sequencing12 zijn nu beschikbaar voor C. elegans. Een belangrijke uitdaging blijft echter: bij het monitoren van interindividualiteit vallen zwak uitgedrukte genen vaak onder detecteerbare niveaus13. Dit is met name relevant voor zeldzame transcripties geïsoleerd van kleine hoeveelheden uitgangsmateriaal, aangezien er een gevestigde, omgekeerde relatie is tussen gemiddelde expressie en technische variantie, waardoor zeldzame transcripties vaak onder statistische cutoffs13vallen . De optimalisatie van high-throughput multiplexed qPCR-technologieën is nuttig gebleken voor eencellige studies bij zoogdieren, met name bij het bestuderen van de expressie van zeldzame transcripties14,15. Deze technologie kan ook worden gebruikt voor benchmarking- en validatiedoeleinden van andere technologieën met één worm.
Worm-naar-CT is een snelle, robuuste methode aangepast aan een kit die wordt gebruikt in celbiologiestudies, voor cDNA-preparaat met één worm. cDNA verkregen door deze methode in combinatie met multiplexed nanofluidic qPCR-technologie werd gekozen omdat het een hogere experimentele doorvoer biedt, een breder dynamisch detectiebereik en is gevalideerd voor eencellige doeleinden14,15. Het beschreven cDNA-preparaat is ook toepasbaar voor gebruik met standaard PCR-technologieën. De doorvoer wordt op twee manieren verhoogd: ten eerste is cDNA-preparaat sneller en betrouwbaarder dan traditionele guanidium thiocyanaat-fenol-chloroformextractie, omdat wormen rechtstreeks aan de lysisbuffer worden toegevoegd, waardoor directe isolatie van gemakkelijk afbreekbaar RNA wordt overgeslagen. Ten tweede verhoogt het gebruik van nanofluïdische technologieën het aantal monsters en doelen dat tegelijkertijd kan worden uitgevoerd aanzienlijk. In dit artikel worden twee chips vergeleken: een single-array chip en een multi-array chip. Een single-array chip kan 96 single worms en 96 primer sets draaien, wat resulteert in 9.216 reacties per experiment. Om een vergelijkbare doorvoer te bereiken met behulp van standaard qPCR-technologieën zouden 96 afzonderlijke qPCR-experimenten nodig zijn, met behulp van 96 putplaten. De kleinere en flexibelere multi-array chip bestaat uit zes 12 x 12 arrays wat resulteert in 864 reacties. De superieure betrouwbaarheid en gevoeligheid van de methode worden versterkt door nanofluïdische technologie en door de introductie van een preamplificatiestap. De methode die in dit artikel wordt gepresenteerd, is bedoeld om samen met een state-of-the-art statistisch algoritme te worden gebruikt om biologische variantie te extraheren. Dit artikel presenteert het protocol voor snelle cDNA-voorbereiding en qPCR met hoge doorvoer voor zowel single-worm- als batchwormmonsters; het algoritme zal elders worden gepubliceerd. Voor dit protocol moet de organisatie van elke chip voorafgaand aan het experiment worden voorbereid. Tabel 1 en tabel 2 geven voorbeelden van deze plannen voor respectievelijk een multi-array en single-array chip. Er zijn ook overzichten van het Worm-to-CT-protocol dat is beschreven in figuur 1 en waarop de multi-array- en single-arraychips in figuur 2 wordenuitgevoerd.
In dit artikel wordt aangetoond dat het Worm-to-CT-protocol een snelle en efficiënte methode is om RNA uit enkele wormen of een kleine pool van wormen te extraheren. De hoge doorvoer die het nanofluïdische systeem biedt, maakt het ideaal voor kwantificering van inter-individuele variabiliteitsmetingen. Bovendien maakt de hoge gevoeligheid van deze methode de detectie mogelijk van genen die worden uitgedrukt op lage niveaus die onder detectie vallen bij het gebruik van RNA-seq-technologieën met één worm9.
Bij het overwegen van de keuze van de methode om cDNA uit enkele wormen voor te bereiden. Ly et al.29 optimaliseert een protocol dat afhankelijk is van proteinase K voor de vertering van nagelriemen. De nagelriem is een belangrijke hindernis voor de isolatie van moleculen van wormen en proteinase K biedt een effectieve methode om het te breken. Proteinase K moet echter warmte-geïnactiveerd worden om enzymen te kunnen gebruiken voor reverse transcriptie. Terwijl Ly et al. een blootstelling van 10 minuten aan 96 °C gebruikten, werd deze stap in dit protocol vermeden omdat RNA gemakkelijk afbreekbaar is. In plaats van proteinase K te gebruiken, werden herhaalde vriesdooicycli gebruikt om de nagelriem te breken. De vriesdooi is een effectieve methode om de nagelriem te breken omdat per worm meer RNA kan worden geïsoleerd. Ly et al. melden dat het totale RNA dat per worm wordt geëxtraheerd 35 ng is met behulp van proteinase K, terwijl dit protocol 51,75 ng ± 6,74 SEM van het totale RNA per worm verkrijgt. Het vermijden van blootstelling aan hitte in combinatie met preamplificatiestappen verruimt blijkbaar worm-naar-CT’s dynamische detectiebereik in vergelijking met standaardprotocollen. Ly et al. rapporteren absolute Ct-waarden van 21,1 ± 0,15 voor hsp-16,2 en 22,8 ± 0,17 voor hsp-70 na hitteschok. Met dezelfde hitteschokomstandigheden (1 uur bij 30 °C) verkrijgt dit protocol absolute Ct-waarden van 17,93 ± 0,57 voor hsp-16,2 en 21,13 ±0,33 voor hsp-70. Dit geeft aan dat de freeze-thaw lysis-methode hogere opbrengsten van RNA biedt en meer geschikt is voor laag uitgedrukte transcripties.
Nanofluïdische systemen zijn ideaal bij het onderzoeken van een bepaalde set doeltranscripties en het gebruik van een kleiner (multi-array chip) of een groter (single-array chip) aantal monsters dat aanpassing aan de schaal van het experiment mogelijk maakt. Om een onbevooroordeeld beeld te krijgen van alle transcripties uitgedrukt in een enkele worm, is de voor de hand liggende keuze om RNA-sequencing te gebruiken. Als de focus van het experiment echter een kleinere maar nog steeds relatief grote set doelgenen is, is het kosteneffectiever om dit protocol te gebruiken, op voorwaarde dat de onderzoeker toegang heeft tot een pcr-machine met nanofluïdica. De kosten van de nanofluïdische systeemreagentia en een single-array chip worden geschat op ongeveer £ 13 per worm, terwijl de kosten van de reagentia voor sequencing met één worm ongeveer £ 60 per worm zouden bedragen, exclusief de sequencingkosten.
Bij het overwegen van welk PCR-platform te gebruiken, biedt de Worm-to-CT-methode gekoppeld aan nanofluïdische qPCR voordelen met betrekking tot tijd en doorvoer. Het is mogelijk om 9.216 RT-qPCR-resultaten te verkrijgen in ongeveer 2 dagen werk, terwijl versterking van hetzelfde aantal doelen met behulp van een standaard qPCR-platform ongeveer 5 werkweken zou duren met behulp van 96 putplaattests, met vier platen per dag. Als het aantal te testen doelen echter kleiner is, is het kosteneffectiever om Worm-to-CT te gebruiken in combinatie met een standaard qPCR-machine. De single-array chips kunnen niet opnieuw worden uitgevoerd, dus het uitvoeren van lege putten vermindert de kostenefficiëntie.
Een beperking van de methode is de potentiële vorming van primerprimer dimers tijdens de multiplexing stap, maar dit gebeurt in minder dan 1% van de gevallen. Hoewel het Worm-to-CT-protocol efficiënt is en betrouwbare resultaten biedt wanneer het wordt toegepast op afzonderlijke wormen, is er een faalpercentage van ongeveer 5%, wat waarschijnlijk overeenkomt met gevallen waarin de worm tijdens de oogststap vast blijft zitten in de dop of de bovenkant van de buis.
Samen biedt deze veelzijdige en betrouwbare methode een verhoogde doorvoer en gevoeligheid in vergelijking met meer standaardtechnieken. Deze methode kan zeer nuttig zijn voor de validatie van schermen met een hoge doorvoer en is een uitstekende keuze om genexpressieniveaus met één worm te bewaken of te valideren. Deze methode kan worden toegepast op andere uitdagende technieken, zoals het kwantificeren van genexpressie uit geïsoleerde weefsels. Isolatie van volledige weefsels, zoals de darm, gonaden of cellen geïsoleerd door FACs, biedt bijvoorbeeld voldoende materiaal om RNA-sequencing-experimenten uit te voeren. Beperkte hoeveelheden materiaal leiden echter vaak tot gedupliceerde leesbewerkingen, wat kwantificering van zeldzame transcripties uitsluit. In dit scenario moet het gebruik van op nanofluidics gebaseerde technologie extra gevoeligheid voor de experimenten bieden en de kostenefficiëntie verhogen als de onderzoekers slechts een subset van alle transcripties in die weefsels of cellen hoeven te controleren.
The authors have nothing to disclose.
We danken Sharlene Murdoch en de Faciliteiten van het Babraham Institute voor hun steun. JLP werd ondersteund door de Wellcome Trust (093970/Z/10/Z) en OC wordt ondersteund door ERC 638426 en BBSRC [BBS/E/B000C0426].
100µM stock primers for genes of interest. | |||
20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | for 96.96 chip (Single-Array Chip) |
2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | 100-7611 | |
384 well plates | |||
8-strip PCR tubes | |||
96 well ice block | |||
96 well plates | |||
96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M-96.96 | Referenced throughout the manuscript as "Single-Array Chip" |
96-well sealing tape | |||
BioMark & EP1 Software | Fluidigm | 101-6793 | Contains: Biomark HD Data Collection software, Real-Time PCR Analysis software, SNP Genotyping Analysis software, Digital PCR Analysis software, Melt Curve Analysis software |
BioMark or BioMark HD system | Fluidigm | 100-2451 K1 | Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics thermocycler" |
Control Line Fluid Kit for 96.96 and FlexSix IFCs | Fluidigm | 89000021 | Referenced throughout manuscript as "control line fluid" |
DNA Suspension buffer | TEKnova | T0021 | |
domed PCR caps | |||
Exonuclease I | New England BioLabs | M0293L | |
Exonuclease I reaction buffer | New England BioLabs | B0293S | |
FLEXsix DELTAgene Sample Reagent | Fluidigm | 100-7673 | referenced throughout manuscript as "sample reagent" |
FLEXsix Gene Expression IFC | Fluidigm | 100-6308 | referenced throughout manuscript as "Multi-Array Chip" |
Fluidigm Real-Time PCR Analysis User Guide | Fluidigm | 68000088 | This is the protocol used as a basis for section 2 of the protocol, referenced within the manuscript. |
IFC Controller MX | Fluidigm | 68000112 I1 | Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics PCR priming machine" |
IFC Controllers SOFTWEAR | Fluidigm | 100-2297 | Contains all softwear and scripts required for running the IFC controller MX |
liquid nitrogen in dewar | |||
Microcentrifuge | StarLab | C1301B-230V | Used to spin down PCR tube strips in the protocol. |
Nuclease Free Water | |||
plate spinner | Labnet | K4050725 | mini plate spinner, mps 1000. referenced through the protocol as "tabletop plate spinner" |
Power SYBR Green Cells-to-Ct kit | invitrogen | 4402955 | This kit is that which is adapted for use in nematodes in the Worm-to-CT protocol. Contense: Store Stop Solution, DNase I and 20X RT Enzyme Mix at -20°C. Store Lysis Solution, 2X SYBR RT Buffer (referenced throughout the manuscript as RT buffer), and Power SYBR®Green PCR Master Mix (refferenced througout the manuscript as PCR Master Mix). This Kit is for 400 reactions, kits also available for 40 and 100 reactions. |
PreAmp Master Mix | Fluidigm | 100-5580, 100-5581 | |
Reverse Transcription Master Mix—480 reactions | Fluidigm | 100-6299 | One tube also available for 96 reactions (PN100-6298) |
Rnase Free water | |||
SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX | Bio-Rad Laboratories | 172-5211 | referenced throughout the manuscript as "fluorescent probe supermix" |
Standard 96 and 384-well Thermal Cycler | |||
TE Buffer (10mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTA | TEKnova | T0224 | Referenced throughout the manuscript as Tris-EDTA buffer |
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000031 | Referenced throughout the text as "thermal mixer" |
Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | Referenced through the protocol as "guanidium thiocyanate-phenol-chloroform" |
Warm water bath |