Neste artigo é descrito um protocolo de alto rendimento para determinação rápida e confiável dos níveis de expressão genética em amostras de C. elegans única ou a granel. Este protocolo não requer isolamento de RNA e produz cDNA diretamente a partir de amostras. Ele pode ser usado em conjunto com plataformas qPCR nanofluidas nanofluidas de alto rendimento.
Este artigo apresenta um ensaio de pcr quantitativo de transcrição reversa de alta taxa de transferência (RT-qPCR) para elegans caenorhabditis que é rápido, robusto e altamente sensível. Este protocolo obtém medições precisas da expressão genética de vermes únicos ou de amostras em massa. O protocolo aqui apresentado fornece uma nova adaptação dos métodos existentes para a preparação de DNA complementar (cDNA) acoplado a uma plataforma RT-qPCR nanofluida. A primeira parte deste protocolo, chamada ‘Worm-to-CT’, permite a produção de cDNA diretamente de nematoides sem a necessidade de isolamento prévio do mRNA. Ele aumenta o rendimento experimental permitindo a preparação de cDNA de 96 worms em 3,5 h. A segunda parte do protocolo usa a tecnologia nanofluida existente para executar RT-qPCR de alto rendimento no cDNA. Este artigo avalia dois chips nanofluidos diferentes: o primeiro executa 96 amostras e 96 alvos, resultando em 9.216 reações em aproximadamente 1,5 dias de trabalho de bancada. O segundo tipo de chip consiste em seis matrizes 12 x 12, resultando em 864 reações. Aqui, o método Worm-to-CT é demonstrado quantificando os níveis de mRNA de genes codificando proteínas de choque térmico de vermes únicos e de amostras em massa. Providenciado é uma extensa lista de primers projetados para amplificar o RNA processado para a maioria dos genes de codificação dentro do genoma C. elegans.
A otimização do sequenciamento de RNA unicelular e do qPCR revelou que pulsos ou rajadas transcricionais podem levar a uma variação maciça no número de moléculas de RNA por célula1. Além disso, essas tecnologias descobriram heterogeneidade celular substancial anteriormente perdida por medições transcriômicas em massa padrão. Dependendo do contexto, alguma variabilidade transcricional unicelular é causada pela composição celular mista dos tecidos. No entanto, mesmo em populações de células isogênicas cultivadas sob o mesmo ambiente há heterogeneidade transcricional generalizada2,3. Essa “variabilidade biológica” é cada vez mais identificada como uma propriedade onipresente das redes celulares, de bactérias ao homem. Em alguns casos, pode ter consequências fenotípicas no desenvolvimento, progressão do câncer, latência do HIV e resposta à quimioterapia4,5.
O nematode Caenorhabditis elegans é um organismo modelo único com características ideais para estudar as causas e consequências da variabilidade biológica entre os indivíduos. Estes nematoides são um organismo modelo simples composto por 959 células, e sua cutícula transparente as torna favoráveis para estudos de imagem in vivo6. C. elegans é uma espécie hermafrodita que se reproduz predominantemente através da auto-fertilização; isso resultou em cepas de laboratório isogênicas. Apesar da isogenicidade e das condições de cultura controladas, muitos fenótipos e transcrições são variáveis entre os indivíduos, sugerindo que diferenças estocásticas ou microambientais contribuem para a heterogeneidade entre indivíduos7,8. Tal variabilidade na expressão genética tem múltiplas consequências de aptidão, incluindo variabilidade na penetração de mutações, sobrevivência, tempo de desenvolvimento e fecundidade7,8,9. Devido a essas características, estudos de verme único proporcionam a oportunidade sem precedentes de estudar a variabilidade biológica em todo um organismo.
Há uma necessidade fundamental no campo de desenvolver e otimizar tecnologias para detecção precisa de transcrições em um nível de um único worm. Novas tecnologias, como sequenciamento de RNA de um único verme10,sequenciamento de RNA de tecidos isolados11e sequenciamento unicelular12 estão agora disponíveis para C. elegans. No entanto, um dos principais desafios permanece: ao monitorar a interindividualidade, genes fracamente expressos geralmente ficam abaixo dos níveis detectáveis13. Isso é particularmente relevante para transcrições raras isoladas de pequenas quantidades de material inicial, pois há uma relação bem estabelecida e inversa entre expressão média e variância técnica, muitas vezes fazendo com que transcrições raras fiquem abaixo dos cortes estatísticos13. A otimização de tecnologias qPCR multiplexed de alto rendimento tem se mostrado útil para estudos de células únicas de mamíferos, em particular ao estudar a expressão de transcrições raras14,15. Esta tecnologia também pode ser usada para fins de benchmarking e validação de outras tecnologias de um único worm.
Worm-to-CT é um método rápido e robusto adaptado de um kit usado em estudos de biologia celular, para preparação de cDNA de um único verme. cDNA obtido por este método juntamente com a tecnologia qPCR nanofluidica multiplexada foi escolhida porque fornece maior throughput experimental, uma gama dinâmica mais ampla de detecção e foi validada para fins unicelulares14,15. A preparação cDNA descrita também é aplicável para uso com tecnologias pcr padrão. O rendimento é aumentado de duas maneiras: Primeiro, a preparação do CDNA é mais rápida e confiável do que a tradicional extração de tiocianato-fenol-clorofônio de guanidium, porque os vermes são diretamente adicionados ao tampão de lise, pulando o isolamento direto do RNA facilmente degradável. Em segundo lugar, a utilização de tecnologias nanofluidas aumenta significativamente o número de amostras e alvos que podem ser executados simultaneamente. Neste papel, dois chips são comparados: um chip de matriz única e um chip multi array. Um chip de matriz única pode executar 96 worms únicos e 96 conjuntos de primer, resultando em 9.216 reações por experimento. Para realizar um throughput semelhante usando tecnologias padrão qPCR seria necessário 96 experimentos qPCR separados, usando 96 placas de poço. O chip multi array menor e flexível consiste em seis matrizes 12 x 12, resultando em 864 reações. A confiabilidade e sensibilidade superiores do método são impulsionadas pela tecnologia nanofluida e pela introdução de uma etapa de pré-amplificação. O método apresentado neste artigo deve ser utilizado em conjunto com um algoritmo estatístico de última geração para extrair variância biológica. Este artigo apresenta o protocolo para preparação rápida de CDNA e qPCR de alto rendimento para amostras de vermes de um único verme e lote; o algoritmo será publicado em outro lugar. Para este protocolo, a organização de cada chip deve ser preparada antes do experimento. A Tabela 1 e a Tabela 2 mostram exemplos desses planos para um chip multi array e single array, respectivamente. Há também visões gerais do protocolo Worm-to-CT detalhadas na Figura 1 e executando os chips multi array e single-array na Figura 2.
Neste artigo, o protocolo Worm-to-CT é mostrado como um método rápido e eficiente para extrair RNA de vermes únicos ou um pequeno pool de worms. O alto rendimento oferecido pelo sistema nanofluido torna-o ideal para quantificação de medidas de variabilidade inter-individual. Além disso, a alta sensibilidade deste método permite a detecção de genes expressos em níveis baixos que ficam abaixo da detecção ao usar tecnologias RNA-seq de um wormúnico 9.
Ao considerar a escolha do método para preparar cDNA a partir de worms únicos. Ly et al.29 otimizaram um protocolo que depende de proteinase K para digestão de cutículas. A cutícula é um grande obstáculo para o isolamento de moléculas de vermes e proteinase K fornece um método eficaz para quebrá-la. No entanto, proteinase K tem que ser inativado pelo calor para poder usar enzimas para transcrição reversa. Enquanto Ly et al. usaram uma exposição de 10 min a 96 °C, esta etapa foi evitada neste protocolo porque o RNA é facilmente degradável. Em vez de usar proteinase K, ciclos repetidos de congelamento foram usados para quebrar a cutícula. O congelamento é um método eficaz para quebrar a cutícula porque mais RNA pode ser isolado por verme. Ly et al. relatam que o total de RNA extraído por verme é de 35 ng usando proteinase K, enquanto este protocolo obtém 51,75 ng ± 6,74 SEM do total de RNA por worm. Evitar a exposição ao calor juntamente com as etapas de pré-amplificação aparentemente amplia o alcance dinâmico de detecção do Worm-to-CT em comparação com os protocolos padrão. Ly et al. relatório valores absolutos ct de 21,1 ± 0,15 para hsp-16.2 e 22,8 ± 0,17 para hsp-70 após choque térmico. Utilizando as mesmas condições de choque térmico (1 h a 30 °C), este protocolo obtém valores absolutos de TC de 17,93 ± 0,57 para hsp-16.2 e 21,13 ±0,33 para hsp-70. Isso indica que o método de congelamento proporciona maiores rendimentos de RNA e é mais apropriado para transcrições mal expressas.
Sistemas nanofluidos são ideais ao investigar um determinado conjunto de transcrições-alvo e o uso de um número menor (chip multi array) ou maior (chip de matriz única) permitindo a adaptação à escala do experimento. Para obter uma imagem imparcial de todas as transcrições expressas em um único worm, a escolha óbvia é usar sequenciamento de RNA. Se, no entanto, o foco do experimento é um conjunto menor, mas ainda relativamente grande de genes-alvo, é mais econômico utilizar este protocolo, desde que o pesquisador tenha acesso a uma máquina PCR nanofluida. O custo dos reagentes do sistema nanofluido e de um chip de matriz única é estimado em aproximadamente £13 por worm, enquanto os custos dos reagentes para sequenciamento de um único verme seriam de aproximadamente £60 por worm, sem incluir os custos de sequenciamento.
Ao considerar qual plataforma PCR usar, o método Worm-to-CT acoplado ao qPCR nanofluido oferece vantagens em relação ao tempo e rendimento. É possível obter 9.216 resultados de RT-qPCR em aproximadamente 2 dias de trabalho, enquanto a amplificação do mesmo número de alvos usando uma plataforma qPCR padrão levaria aproximadamente 5 semanas de trabalho usando 96 ensaios de placas de poço, executando quatro placas por dia. No entanto, se o número de alvos a serem testados for menor, então é mais econômico usar Worm-to-CT juntamente com uma máquina qPCR padrão. Os chips de matriz única não podem ser reprisados, então executar poços vazios diminui a eficiência de custo.
Uma limitação do método é a formação potencial de primer-primer dimers durante a etapa multiplexa, mas isso ocorre em menos de 1% dos casos. Embora o protocolo Worm-to-CT seja eficiente e forneça resultados confiáveis quando aplicado a worms únicos, há uma taxa de falha de cerca de 5%, o que provavelmente corresponde aos casos em que o verme permanece preso na tampa ou no topo do tubo durante a etapa de colheita.
Juntos, este método versátil e confiável oferece maior rendimento e sensibilidade em comparação com técnicas mais padrão. Este método pode ser muito útil para validação de telas de alto rendimento e é uma excelente escolha para monitorar ou validar níveis de expressão genética de um único verme. Este método pode ser aplicado a outras técnicas desafiadoras, como a quantitação da expressão genética a partir de tecidos isolados. Por exemplo, o isolamento de tecidos completos, como intestino, gôndas ou células isoladas pelos FACs, fornece material suficiente para realizar experimentos de sequenciamento de RNA. No entanto, quantidades limitadas de material muitas vezes levam a leituras duplicadas, o que impede a quantitação de transcrições raras. Neste cenário, o uso da tecnologia baseada em nanofluidos deve fornecer mais sensibilidade aos experimentos e aumentar o custo-eficiência se os pesquisadores precisarem monitorar apenas um subconjunto de todas as transcrições nesses tecidos ou células.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Sharlene Murdoch e ao Instituto Babraham Facilities pelo apoio. A JLP foi apoiada pelo Wellcome Trust (093970/Z/10/Z) e o OC é suportado pela ERC 638426 e BBSRC [BBS/E/B000C0426].
100µM stock primers for genes of interest. | |||
20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | for 96.96 chip (Single-Array Chip) |
2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | 100-7611 | |
384 well plates | |||
8-strip PCR tubes | |||
96 well ice block | |||
96 well plates | |||
96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M-96.96 | Referenced throughout the manuscript as "Single-Array Chip" |
96-well sealing tape | |||
BioMark & EP1 Software | Fluidigm | 101-6793 | Contains: Biomark HD Data Collection software, Real-Time PCR Analysis software, SNP Genotyping Analysis software, Digital PCR Analysis software, Melt Curve Analysis software |
BioMark or BioMark HD system | Fluidigm | 100-2451 K1 | Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics thermocycler" |
Control Line Fluid Kit for 96.96 and FlexSix IFCs | Fluidigm | 89000021 | Referenced throughout manuscript as "control line fluid" |
DNA Suspension buffer | TEKnova | T0021 | |
domed PCR caps | |||
Exonuclease I | New England BioLabs | M0293L | |
Exonuclease I reaction buffer | New England BioLabs | B0293S | |
FLEXsix DELTAgene Sample Reagent | Fluidigm | 100-7673 | referenced throughout manuscript as "sample reagent" |
FLEXsix Gene Expression IFC | Fluidigm | 100-6308 | referenced throughout manuscript as "Multi-Array Chip" |
Fluidigm Real-Time PCR Analysis User Guide | Fluidigm | 68000088 | This is the protocol used as a basis for section 2 of the protocol, referenced within the manuscript. |
IFC Controller MX | Fluidigm | 68000112 I1 | Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics PCR priming machine" |
IFC Controllers SOFTWEAR | Fluidigm | 100-2297 | Contains all softwear and scripts required for running the IFC controller MX |
liquid nitrogen in dewar | |||
Microcentrifuge | StarLab | C1301B-230V | Used to spin down PCR tube strips in the protocol. |
Nuclease Free Water | |||
plate spinner | Labnet | K4050725 | mini plate spinner, mps 1000. referenced through the protocol as "tabletop plate spinner" |
Power SYBR Green Cells-to-Ct kit | invitrogen | 4402955 | This kit is that which is adapted for use in nematodes in the Worm-to-CT protocol. Contense: Store Stop Solution, DNase I and 20X RT Enzyme Mix at -20°C. Store Lysis Solution, 2X SYBR RT Buffer (referenced throughout the manuscript as RT buffer), and Power SYBR®Green PCR Master Mix (refferenced througout the manuscript as PCR Master Mix). This Kit is for 400 reactions, kits also available for 40 and 100 reactions. |
PreAmp Master Mix | Fluidigm | 100-5580, 100-5581 | |
Reverse Transcription Master Mix—480 reactions | Fluidigm | 100-6299 | One tube also available for 96 reactions (PN100-6298) |
Rnase Free water | |||
SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX | Bio-Rad Laboratories | 172-5211 | referenced throughout the manuscript as "fluorescent probe supermix" |
Standard 96 and 384-well Thermal Cycler | |||
TE Buffer (10mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTA | TEKnova | T0224 | Referenced throughout the manuscript as Tris-EDTA buffer |
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000031 | Referenced throughout the text as "thermal mixer" |
Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | Referenced through the protocol as "guanidium thiocyanate-phenol-chloroform" |
Warm water bath |