Avaliação do estresse oxidativo em amostras biológicas usando o ensaio de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico

A peroxidação lipídica é um processo no qual radicais livres, como espécies reativas de oxigênio e espécies reativas de nitrogênio, atacam ligações duplas carbono-carbono em lipídios, um processo que envolve a abstração de um hidrogênio a partir de um carbono e inserção de uma molécula de oxigênio. Esse processo leva a uma mistura de produtos complexos, incluindo, radicais lipídicos e hidroperóxidos como produtos primários, bem como malondialdeído (MDA) e 4-hidroxynonenal como produtos secundários ^{predominantes1}.

O MDA tem sido amplamente utilizado em pesquisas biomédicas como um marcador de peroxidação lipídica devido à sua reação fácil com ácido tiobarbitúrico (TBA). A reação leva à formação do MDA-TBA2, um conjugado que absorve no espectro visível a 532 nm e produz uma cor vermelho-rosa2. Outras moléculas derivadas da peroxidação lipídica além do MDA também podem reagir com TBA e absorver luz a 532 nm, contribuindo para o sinal de absorção global que é medido. Da mesma forma, o MDA pode reagir com a maioria das outras classes principais de biomoléculas, potencialmente limitando sua acessibilidade para reação com ^TBA3,4. Como tal, este ensaio tradicional é simplesmente considerado para medir “substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico” ou ^TBARS5.

Quando corretamente aplicado e interpretado, o ensaio TBARS é geralmente considerado um bom indicador dos níveis globais de estresse oxidativo em uma amostra ^biológica6. Infelizmente, como documentado por Khoubnasabjafari e outros, o ensaio TBARS é frequentemente conduzido e interpretado de maneiras que facilitam conclusões duvidosas3,4,7,8,9,10,11. As causas para isso estão enraizadas principalmente em variáveis pré-analíticas relacionadas à amostra e na falta de robustez de ensaios que proíbe variações aparentemente menores no protocolo de ensaio sem alterações substanciais nos resultados ^do ensaio1,7,12,13.

Variáveis pré-analíticas relacionadas ao manuseio e armazenamento de bioespecímen (por exemplo, o plasma de sangue mantido temporariamente a -20 °C)^14,15 podem ter um grande impacto nos resultados do ensaio TBARS16,17; tanto que os resultados do ensaio TBARS não devem ser comparados em diferentes laboratórios, a menos que seja justificado por dados explícitos de validação analítica interlaboratória. Esta recomendação é semelhante à forma como as manchas ocidentais são comumente usadas e interpretadas. Comparações de densidades de banda são válidas para estudos dentro da mancha e talvez dentro de laboratório, mas comparar densidades de banda entre laboratórios é geralmente considerado uma prática inválida.

Alguns pesquisadores sugeriram que o MDA medido pelo ensaio TBARS simplesmente não atende aos critérios analíticos ou clínicos exigidos de um biomarcador aceitável3,9,10,18,19. De fato, se o ensaio não tivesse sido desenvolvido há mais de 50 anos, provavelmente não teria ganho o uso generalizado e a aceitabilidade tácita que tem hoje. Embora existam outros ensaios com maior sensibilidade analítica, especificidade e robustez utilizadas para determinar o estresse oxidativo, o ensaio TBARS baseado na absorção a 532 nm permanece de longe um dos ensaios mais utilizados para a determinação da peroxidação ^lipídica20, e assim a avaliação do estresse oxidativo.

O ensaio TBARS só pode ser encontrado como um kit caro (mais de 400 dólares americanos), no qual as instruções não fornecem informações detalhadas sobre a maioria das concentrações dos reagentes utilizados. Além disso, os reagentes fornecidos só podem ser usados para um experimento, pois apenas uma curva padrão colorimétrica pode ser feita por kit. Isso pode ser problemático para pesquisadores que pretendem determinar níveis de oxidação dentro de algumas amostras em diferentes pontos de tempo, porque a mesma curva padrão não pode ser usada em vários momentos. Portanto, vários kits precisam ser comprados para vários experimentos. Atualmente, a menos que um kit caro seja comprado, não há um protocolo detalhado disponível para como realizar um ensaio TBARS. Alguns pesquisadores no passado descreveram vagamente como realizar um ensaio ^TBARS21,22, mas nem um protocolo totalmente detalhado ou um vídeo abrangente sobre como conduzir o ensaio TBARS sem um kit caro está disponível na literatura.

Aqui relatamos uma metodologia detalhada e analiticamente validada para fins sobre como realizar um ensaio TBARS de forma simples, reprodutível e barata. Alterações na peroxidação lipídica do soro humano, lisatos hepG2 e lipoproteínas de baixa densidade após o tratamento com íons cu(II) são demonstradas como aplicações ilustrativas para o ensaio TBARS. Os resultados demonstram que este ensaio TBARS é consistente e reproduzível no dia-a-dia.