تقييم الإجهاد التأكسدي في العينات البيولوجية باستخدام اختبار المواد التفاعلية حمض ثيوباربيتريك

البيروكسيد الدهني هو عملية تهاجم فيها الجذور الحرة، مثل أنواع الأكسجين التفاعلية وأنواع النيتروجين التفاعلية، الروابط المزدوجة بين الكربون والكربون في الدهون، وهي عملية تنطوي على تجريد الهيدروجين من الكربون وإدخال جزيء الأكسجين. هذه العملية تؤدي إلى خليط من المنتجات المعقدة بما في ذلك، الجذور البيروكسيدات الدهنية، والهيدروكسيدات والمنتجات الأولية، وكذلك malondialdehyde (MDA) و 4 هيدروكسينالونال كمنتجات ثانوية ^{السائدة1}.

وقد استخدمت على نطاق واسع MDA في البحوث الطبية الحيوية كعلامة على البيروكسيد الدهون بسبب رد فعل سهل مع حمض ثيوباربيتريك (TBA). رد الفعل يؤدي إلى تشكيل MDA-TBA2، وهو اقتران يمتص في الطيف المرئي في 532 نانومتر وتنتج اللون الأحمر ^{والوردي2}. الجزيئات الأخرى المستمدة من بيروكسيد الدهون إلى جانب MDA يمكن أن تتفاعل أيضا مع TBA وتمتص الضوء في 532 نانومتر، مما يساهم في إشارة الامتصاص الشاملة التي يتم قياسها. وبالمثل، يمكن أن تتفاعل MDA مع معظم الفئات الرئيسية الأخرى من الجزيئات الحيوية، مما قد يحد من إمكانية الوصول إليها للتفاعل مع ^TBA3،4. على هذا النحو، يعتبر هذا المقايسة التقليدية ببساطة لقياس “المواد التفاعلية حمض ثيوباربيتورك” أو TBARS5.

عند تطبيقها وتفسيرها بشكل صحيح، يعتبر فحص TBARS عموما مؤشرا جيدا للمستويات الإجمالية للإجهاد التأكسدي في عينة ^{بيولوجية6}. ولسوء الحظ، وكما وثقه شوبناساسبيفاري وآخرون، فإن المقايسة التي يجريها هذا النظام كثيرا ما تجرى وتفسر بطرق تيسر استخلاص استنتاجات مشكوك فيها^{(3)4،7،8،9،10،11}. وتعود أسباب ذلك في المقام الأول إلى المتغيرات ما قبل التحليلية المتصلة بالعينة والافتقار إلى وعورة الفحص التي تحظر الاختلافات الطفيفة على ما يبدو في بروتوكول الفحص دون تغييرات جوهرية في نتائج الفحص ^1,7,12,13.

المتغيرات قبل تحليلية المتعلقة بالمناولة البيولوجية وتخزين (على سبيل المثال، بلازما الدم أبقى مؤقتا في -20 درجة مئوية)^14,15 يمكن أن يكون لها تأثير كبير على نتائج TBARS ^{الفحص16,17}; لدرجة أنه لا ينبغي مقارنة نتائج فحص TBARS عبر مختبرات مختلفة ما لم تبررها بيانات التحقق التحليلية الصريحة بين الطوابق. هذه التوصية هي أقرب إلى كيفية استخدام البقع الغربية وتفسيرها. ومقارنات كثافة النطاق صالحة للدراسات داخل البقع وربما داخل المختبر، ولكن مقارنة كثافات النطاق بين المختبرات تعتبر عموما ممارسة غير صالحة.

وقد اقترح بعض الباحثين أن MDA كما تقاس من قبل المقايسة TBARS ببساطة لا تفي بالمعايير التحليلية أو السريرية المطلوبة من علامة بيولوجية مقبولة3,9,10,18,19. والواقع أنه لو لم يتم تطوير المقايسة قبل أكثر من 50 عاما، لما اكتسبت على الأرجح الاستخدام الواسع النطاق والمقبولة الضمنية التي تتمتع بها اليوم. على الرغم من أن هناك مقايسات أخرى ذات حساسية تحليلية أكبر وخصوصية ووعرة تستخدم لتحديد الإجهاد التأكسدي ، إلا أن اختبار TBARS القائم على الامتصاص عند 532 نانومتر لا يزال إلى حد بعيد أحد المقايسات الأكثر شيوعا لتحديد peroxidation20 الدهون ، وبالتالي تقييم الإجهاد التأكسدي.

لا يمكن العثور على اختبار TBARS إلا كطقم باهظ الثمن (أكثر من 400 دولار أمريكي) ، حيث لا توفر التعليمات معلومات مفصلة عن معظم تركيزات الكواشف المستخدمة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الكواشف المقدمة لتجربة واحدة فقط، لأنه يمكن إجراء منحنى قياسي لوني واحد فقط لكل مجموعة. وهذا يمكن أن يكون مشكلة للباحثين الذين يعتزمون تحديد مستويات الأكسدة في غضون بضع عينات في نقاط زمنية مختلفة، لأنه لا يمكن استخدام نفس المنحنى القياسي في عدة مرات. وبالتالي، يجب شراء مجموعات متعددة لإجراء تجارب متعددة. حاليا، ما لم يتم شراء مجموعة مكلفة، لا يوجد بروتوكول مفصل متاح لكيفية إجراء اختبار TBARS. وقد وصف بعض الباحثين في الماضي بشكل غامض كيفية إجراء تقييم TBARS21,22 ، ولكن لا يتوفر في الأدبيات بروتوكول مفصل تماما أو فيديو شامل حول كيفية إجراء فحص TBARS دون مجموعة مكلفة.

هنا نحن تقرير مفصلة، التحقق من صحة تحليليا منهجية لهذا الغرض حول كيفية تنفيذ TBARS المقايسة بطريقة بسيطة، استنساخها، وغير مكلفة. تظهر التغيرات في بيروكسيد الدهون في المصل البشري ، وlysates HepG2 ، والبروتينات الدهنية منخفضة الكثافة عند العلاج مع أيونات Cu(II) كالتطبيقات التوضيحية لمقايسة TBARS. تظهر النتائج أن هذا المقايسة TBARS متناسقة وقابلة للاستنساخ على أساس يومي.