Evaluación del estrés oxidativo en muestras biológicas utilizando el ensayo de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico
Summary
El objetivo del ensayo de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico es evaluar el estrés oxidativo en muestras biológicas midiendo la producción de productos de peroxidación lipídica, principalmente malondialdehído, utilizando espectrofotometría de longitud de onda visible a 532 nm. El método descrito aquí se puede aplicar al suero humano, lisados celulares y lipoproteínas de baja densidad.
Abstract
A pesar de su limitada especificidad analítica y robustez, el ensayo de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) se ha utilizado ampliamente como una métrica genérica de la peroxidación lipídica en fluidos biológicos. A menudo se considera un buen indicador de los niveles de estrés oxidativo dentro de una muestra biológica, siempre que la muestra se haya manipulado y almacenado adecuadamente. El ensayo implica la reacción de productos de peroxidación lipídica, principalmente malondialdehído (MDA), con ácido tiobarbitúrico (TBA), lo que conduce a la formación de aductos MDA-TBA2 llamados TBARS. TBARS produce un color rojo-rosa que se puede medir espectrofotométricamente a 532 nm. El ensayo TBARS se realiza en condiciones ácidas (pH = 4) y a 95 °C. La MDA pura es inestable, pero estas condiciones permiten la liberación de MDA de MDA bis (dimetil acetal), que se utiliza como estándar analítico en este método. El ensayo TBARS es un método sencillo que se puede completar en aproximadamente 2 h. La preparación de los reactivos de ensayo se describe en detalle aquí. Los investigadores conscientes del presupuesto pueden usar estos reactivos para múltiples experimentos a un bajo costo en lugar de comprar un costoso kit de ensayo TBARS que solo permite la construcción de una sola curva estándar (y por lo tanto solo se puede usar para un experimento). La aplicabilidad de este ensayo TBARS se muestra en suero humano, lipoproteínas de baja densidad y lisados celulares. El ensayo es consistente y reproducible, y se pueden alcanzar límites de detección de 1,1 μM. Se proporcionan recomendaciones para el uso e interpretación del ensayo espectrofotométrico TBARS.
Introduction
La peroxidación lipídica es un proceso en el que los radicales libres, como las especies reactivas de oxígeno y las especies reactivas de nitrógeno, atacan los dobles enlaces carbono-carbono en los lípidos, un proceso que implica la extracción de un hidrógeno de un carbono y la inserción de una molécula de oxígeno. Este proceso conduce a una mezcla de productos complejos que incluyen, radicales peroxilo lipídicos e hidroperóxidos como productos primarios, así como malondialdehído (MDA) y 4-hidroxinonenal como productos secundarios predominantes1.
MDA ha sido ampliamente utilizado en la investigación biomédica como un marcador de peroxidación lipídica debido a su reacción fácil con el ácido tiobarbitúrico (TBA). La reacción conduce a la formación de MDA-TBA2, un conjugado que se absorbe en el espectro visible a 532 nm y produce un color rojo-rosa2. Otras moléculas derivadas de la peroxidación lipídica además de MDA también pueden reaccionar con TBA y absorber luz a 532 nm, contribuyendo a la señal de absorción general que se mide. Del mismo modo, MDA puede reaccionar con la mayoría de las otras clases principales de biomoléculas, lo que potencialmente limita su accesibilidad para la reacción con TBA3,4. Como tal, este ensayo tradicional se considera simplemente para medir “sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico” o TBARS5.
Cuando se aplica e interpreta correctamente, el ensayo TBARS generalmente se considera un buen indicador de los niveles generales de estrés oxidativo en una muestra biológica6. Desafortunadamente, como lo documentan Khoubnasabjafari y otros, el ensayo TBARS a menudo se realiza e interpreta de manera que facilita conclusiones dudosas3,4,7,8,9,10,11. Las causas de esto se basan principalmente en variables preanalíticas relacionadas con la muestra y en la falta de robustez del ensayo que prohíbe variaciones aparentemente menores en el protocolo del ensayo sin cambios sustanciales en los resultados del ensayo1,7,12,13.
Las variables preanalíticas relacionadas con el manejo y almacenamiento de bioespecímenes (p. ej., plasma sanguíneo mantenido temporalmente a -20 °C)14,15 pueden tener un impacto importante en los resultados de los ensayos TBARS16,17; tanto es así, que los resultados de los ensayos TBARS no deben compararse entre diferentes laboratorios a menos que estén justificados por datos explícitos de validación analítica entre laboratorios. Esta recomendación es similar a cómo se usan e interpretan comúnmente los western blots. Las comparaciones de densidades de banda son válidas para estudios dentro de la mancha y tal vez dentro del laboratorio, pero la comparación de densidades de banda entre laboratorios generalmente se considera una práctica inválida.
Algunos investigadores han sugerido que la MDA medida por el ensayo TBARS simplemente no cumple con los criterios analíticos o clínicos requeridos de un biomarcador aceptable3,9,10,18,19. De hecho, si el ensayo no se hubiera desarrollado hace más de 50 años, probablemente no habría ganado el uso generalizado y la aceptabilidad tácita que tiene hoy en día. Aunque existen otros ensayos con mayor sensibilidad analítica, especificidad y robustez utilizados para determinar el estrés oxidativo, el ensayo TBARS basado en la absorbancia a 532 nm sigue siendo, con mucho, uno de los ensayos más utilizados para la determinación de la peroxidación lipídica20 y, por lo tanto, la evaluación del estrés oxidativo.
El ensayo TBARS solo se puede encontrar como un kit costoso (más de 400 dólares estadounidenses), en el que las instrucciones no proporcionan información detallada sobre la mayoría de las concentraciones de los reactivos utilizados. Además, los reactivos proporcionados solo se pueden usar para un experimento, porque solo se puede hacer una curva estándar colorimétrica por kit. Esto puede ser problemático para los investigadores que tienen la intención de determinar los niveles de oxidación dentro de unas pocas muestras en diferentes puntos de tiempo, porque la misma curva estándar no se puede usar en múltiples momentos. Por lo tanto, es necesario comprar múltiples kits para múltiples experimentos. Actualmente, a menos que se compre un kit costoso, no hay un protocolo detallado disponible sobre cómo realizar un ensayo TBARS. Algunos investigadores en el pasado han descrito vagamente cómo realizar un ensayo TBARS21,22, pero no hay disponible en la literatura un protocolo completamente detallado o un video completo sobre cómo realizar el ensayo TBARS sin un kit costoso.
Aquí informamos una metodología detallada y analíticamente validada para el propósito sobre cómo realizar un ensayo TBARS de una manera simple, reproducible y económica. Los cambios en la peroxidación lipídica del suero humano, los lisados de HepG2 y las lipoproteínas de baja densidad tras el tratamiento con iones Cu(II) se demuestran como aplicaciones ilustrativas para el ensayo TBARS. Los resultados demuestran que este ensayo TBARS es consistente y reproducible en el día a día.
Protocol
Representative Results
Discussion
A pesar de sus limitaciones1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 y la falta de idoneidad para la comparación entre laboratorios, el ensayo TBARS es uno de los más <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación reportada aquí fue apoyada en parte por el Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud bajo el premio no. R33 CA217702 y el programa iniciativa para maximizar el desarrollo estudiantil (IMSD). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| 1x Sterile PBS pH 7.4 1 L | VWR, PA | 101642–262 | cell lysis reagent |
| 50 mL self-standing centrifuge tube | Corning, NY | CLS430897 | General material |
| 96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile | Thermo Fisher Scientific, MA | 280895 | To measure absorbance |
| Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device | Fisher Scientific, NH | UFC510024 | LDL purification |
| Caps for glass tubes | Thermo Fisher Scientific, MA | 14-930-15D | for TBARS assay |
| Copper II Chloride | SIGMA, MO | 222011-250G | to induce oxidation |
| Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm) | VWR, PA | 53283-800 | for TBARS assay |
| Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) | ATCC, VA | HB-8065 | HepG2 cell media |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | eppendorf, NY | 22363204 | General material |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL | Genesee Sceitific, CA | 22363352 | General material |
| Fetal Bovine Serum US Source | Omega Scientific, CA | FB-11 | for cell culture |
| Glacial Acetic Acid | SIGMA, MO | 27225-1L-R | TBARS Reagent |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Scientific, MA | 87786 | cell lysis reagent |
| HEPES | SIGMA, MO | H3375-250G | LDL solvent |
| HepG2 Cells | ATCC, VA | HB-8065 | Biological matrix prototype |
| Hydrocloric acid (HCl) | Fisher Scientific, NH | A144-212 | cell lysis reagent |
| Legend Micro 17 Centrifuge | Thermo Scientific, MA | 75002431 | General material |
| Low Density Lipoprotein, Human Plasma | Athens Research & Technology, GA | 12-16-120412 | Biological matrix prototype |
| Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment | VWR, PA | 58948-025 | General material |
| Malondialdehyde bis (dimethyl acetal) | SIGMA, MO | 8207560250 | TBARS Standard |
| Multiskan Go Microplate Spectrophotometer | Fisher Scientific, NH | 51119200 | To measure absorbance |
| NP-40 | EMD Millipore Corp, MA | 492016-100ML | cell lysis reagent |
| Sodium Chloride | SIGMA, MO | S7653-1KG | cell lysis reagent |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | SIGMA, MO | 436143-100G | TBARS Reagent |
| Sodium hydroxide | SIGMA, MO | 367176-2.5KG | TBARS Reagent |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific, MA | SC250EXP | For concentrating cell lysates |
| T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap | USA Scientific, FL | 658175 | cell culture |
| Thiobarbituric Acid | SIGMA, MO | T5500-100G | TBARS Reagent |
| TRIS base | Fluka, GA | 93362 | cell lysis reagent |
| Trypsin (1x) | VWR, PA | 16777-166 | To detach HepG2 cells |
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