Bewertung von oxidativem Stress in biologischen Proben mit dem Thiobarbitursäure-Reaktivsubstanz-Assay

Lipidperoxidation ist ein Prozess, bei dem freie Radikale, wie reaktive Sauerstoffspezies und reaktive Stickstoffspezies, Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen in Lipiden angreifen, ein Prozess, der die Abstraktion eines Wasserstoffs aus einem Kohlenstoff und die Insertion eines Sauerstoffmoleküls beinhaltet. Dieser Prozess führt zu einer Mischung komplexer Produkte, einschließlich Lipidperoxylreste und Hydroperoxide als Primärprodukte sowie Malondialdehyd (MDA) und 4-Hydroxynonenal als vorherrschende ^{Sekundärprodukte1}.

MDA wurde in der biomedizinischen Forschung aufgrund seiner einfachen Reaktion mit Thiobarbitursäure (TBA) häufig als Marker für die Lipidperoxidation verwendet. Die Reaktion führt zur Bildung von MDA-TBA2, einem Konjugat, das im sichtbaren Spektrum bei 532 nm absorbiert und eine rot-rosa Farbe ^erzeugt2. Andere Moleküle, die neben MDA aus der Lipidperoxidation stammen, können ebenfalls mit TBA reagieren und Licht bei 532 nm absorbieren, was zum gemessenen Gesamtabsorptionssignal beiträgt. In ähnlicher Weise kann MDA mit den meisten anderen wichtigen Klassen von Biomolekülen reagieren, was möglicherweise seine Zugänglichkeit für die Reaktion mit ^TBA3,4 einschränkt. Daher wird dieser traditionelle Assay einfach als Messung von “Thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen” oder TBARS5 betrachtet.

Bei richtiger Anwendung und Interpretation wird der TBARS-Assay im Allgemeinen als guter Indikator für den Gesamtgehalt des oxidativen Stresses in einer biologischen Probe ^angesehen6. Leider, wie von Khoubnasabjafari und anderen dokumentiert, wird der TBARS-Assay oft auf eine Weise durchgeführt und interpretiert, die zweifelhafte Schlussfolgerungen ermöglicht3,4,7,8,9,10,11. Die Ursachen dafür liegen in erster Linie in probenbezogenen präanalytischen Variablen und einem Mangel an Assay-Robustheit, der scheinbar geringfügige Variationen im Assay-Protokoll ohne wesentliche Änderungen der Assay-Ergebnisse verbietet1,7,12,13.

Präanalytische Variablen im Zusammenhang mit der Handhabung und Lagerung von Bioproben (z. B. Blutplasma, das vorübergehend bei -20 °C gehalten wird)^14,15 können einen großen Einfluss auf die TBARS-Testergebnisse ^haben16,17; so sehr, dass TBARS-Assay-Ergebnisse nicht zwischen verschiedenen Labors verglichen werden sollten, es sei denn, dies wird durch explizite analytische Validierungsdaten zwischen den Labors gerechtfertigt. Diese Empfehlung ähnelt der Art und Weise, wie Western Blots häufig verwendet und interpretiert werden. Vergleiche der Banddichten gelten für Studien innerhalb des Blots und vielleicht innerhalb des Labors, aber der Vergleich der Banddichten zwischen Laboratorien wird im Allgemeinen als ungültige Praxis angesehen.

Einige Forscher haben vorgeschlagen, dass MDA, gemessen mit dem TBARS-Assay, einfach nicht die analytischen oder klinischen Kriterien erfüllt, die für einen akzeptablen Biomarker erforderlich sind3,9,10,18,19. In der Tat, wenn der Assay nicht vor über 50 Jahren entwickelt worden wäre, hätte er wahrscheinlich nicht die weit verbreitete Verwendung und stillschweigende Akzeptanz erlangt, die er heute hat. Obwohl es andere Assays mit größerer analytischer Sensitivität, Spezifität und Robustheit gibt, die zur Bestimmung von oxidativem Stress verwendet werden, bleibt der TBARS-Assay, der auf der Absorption bei 532 nm basiert, bei weitem einer der am häufigsten verwendeten Assays zur Bestimmung der Lipidperoxidation20 und damit zur Bewertung von oxidativem Stress.

Der TBARS-Assay ist nur als teures Kit (über 400 US-Dollar) zu finden, in dem die Anleitung keine detaillierten Informationen über die meisten Konzentrationen der verwendeten Reagenzien liefert. Darüber hinaus können die bereitgestellten Reagenzien nur für ein Experiment verwendet werden, da nur eine kolorimetrische Standardkurve pro Kit hergestellt werden kann. Dies kann für Forscher problematisch sein, die beabsichtigen, den Oxidationsgrad innerhalb weniger Proben zu verschiedenen Zeitpunkten zu bestimmen, da die gleiche Standardkurve nicht mehrmals verwendet werden kann. Daher müssen mehrere Kits für mehrere Experimente gekauft werden. Derzeit gibt es kein detailliertes Protokoll für die Durchführung eines TBARS-Assays, es sei denn, es wird ein teures Kit gekauft. Einige Forscher haben in der Vergangenheit vage beschrieben, wie man einen TBARS-Assay ^{durchführt21,22}, aber weder ein vollständig detailliertes Protokoll noch ein umfassendes Video darüber, wie man den TBARS-Assay ohne ein teures Kit durchführt, ist in der Literatur verfügbar.

Hier berichten wir über eine detaillierte, analytisch validierte Methodik zur Durchführung eines TBARS-Assays auf einfache, reproduzierbare und kostengünstige Weise. Veränderungen in der Lipidperoxidation von humanem Serum, HepG2-Lysaten und Lipoproteinen niedriger Dichte bei der Behandlung mit Cu(II)-Ionen werden als illustrative Anwendungen für den TBARS-Assay nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigen, dass dieser TBARS-Assay im Alltag konsistent und reproduzierbar ist.