Summary

Bewertung von oxidativem Stress in biologischen Proben mit dem Thiobarbitursäure-Reaktivsubstanz-Assay

Published: May 12, 2020
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Summary

Das Ziel des Thiobarbitursäure-Reaktivsubstanz-Assays ist es, oxidativen Stress in biologischen Proben zu bewerten, indem die Produktion von Lipidperoxidationsprodukten, hauptsächlich Malondialdehyd, unter Verwendung der Spektrophotometrie der sichtbaren Wellenlänge bei 532 nm gemessen wird. Die hier beschriebene Methode kann auf menschliches Serum, Zelllysate und Lipoproteine niedriger Dichte angewendet werden.

Abstract

Trotz seiner begrenzten analytischen Spezifität und Robustheit wurde der Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen (TBARS) Assay weit verbreitet als generische Metrik der Lipidperoxidation in biologischen Flüssigkeiten verwendet. Es wird oft als ein guter Indikator für den Grad des oxidativen Stresses in einer biologischen Probe angesehen, vorausgesetzt, die Probe wurde ordnungsgemäß gehandhabt und gelagert. Der Assay beinhaltet die Reaktion von Lipidperoxidationsprodukten, hauptsächlich Malondialdehyd (MDA), mit Thiobarbitursäure (TBA), was zur Bildung von MDA-TBA2-Addukten namens TBARS führt. TBARS ergibt eine rot-rosa Farbe, die spektralphotometrisch bei 532 nm gemessen werden kann. Der TBARS-Assay wird unter sauren Bedingungen (pH = 4) und bei 95 °C durchgeführt. Reines MDA ist instabil, aber diese Bedingungen erlauben die Freisetzung von MDA aus MDA-Bis (Dimethylacetal), das als analytischer Standard in dieser Methode verwendet wird. Der TBARS-Assay ist eine einfache Methode, die in etwa 2 h abgeschlossen werden kann. Die Herstellung von Assay-Reagenzien wird hier ausführlich beschrieben. Budgetbewusste Forscher können diese Reagenzien für mehrere Experimente zu geringen Kosten verwenden, anstatt ein teures TBARS-Assay-Kit zu kaufen, das nur die Konstruktion einer einzigen Standardkurve erlaubt (und somit nur für ein Experiment verwendet werden kann). Die Anwendbarkeit dieses TBARS-Assays wird in humanem Serum, Lipoproteinen niedriger Dichte und Zelllysaten gezeigt. Der Assay ist konsistent und reproduzierbar, und es können Nachweisgrenzen von 1,1 μM erreicht werden. Es werden Empfehlungen für die Verwendung und Interpretation des spektralphotometrischen TBARS-Assays gegeben.

Introduction

Lipidperoxidation ist ein Prozess, bei dem freie Radikale, wie reaktive Sauerstoffspezies und reaktive Stickstoffspezies, Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen in Lipiden angreifen, ein Prozess, der die Abstraktion eines Wasserstoffs aus einem Kohlenstoff und die Insertion eines Sauerstoffmoleküls beinhaltet. Dieser Prozess führt zu einer Mischung komplexer Produkte, einschließlich Lipidperoxylreste und Hydroperoxide als Primärprodukte sowie Malondialdehyd (MDA) und 4-Hydroxynonenal als vorherrschende Sekundärprodukte1.

MDA wurde in der biomedizinischen Forschung aufgrund seiner einfachen Reaktion mit Thiobarbitursäure (TBA) häufig als Marker für die Lipidperoxidation verwendet. Die Reaktion führt zur Bildung von MDA-TBA2, einem Konjugat, das im sichtbaren Spektrum bei 532 nm absorbiert und eine rot-rosa Farbe erzeugt2. Andere Moleküle, die neben MDA aus der Lipidperoxidation stammen, können ebenfalls mit TBA reagieren und Licht bei 532 nm absorbieren, was zum gemessenen Gesamtabsorptionssignal beiträgt. In ähnlicher Weise kann MDA mit den meisten anderen wichtigen Klassen von Biomolekülen reagieren, was möglicherweise seine Zugänglichkeit für die Reaktion mit TBA3,4 einschränkt. Daher wird dieser traditionelle Assay einfach als Messung von “Thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen” oder TBARS5 betrachtet.

Bei richtiger Anwendung und Interpretation wird der TBARS-Assay im Allgemeinen als guter Indikator für den Gesamtgehalt des oxidativen Stresses in einer biologischen Probe angesehen6. Leider, wie von Khoubnasabjafari und anderen dokumentiert, wird der TBARS-Assay oft auf eine Weise durchgeführt und interpretiert, die zweifelhafte Schlussfolgerungen ermöglicht3,4,7,8,9,10,11. Die Ursachen dafür liegen in erster Linie in probenbezogenen präanalytischen Variablen und einem Mangel an Assay-Robustheit, der scheinbar geringfügige Variationen im Assay-Protokoll ohne wesentliche Änderungen der Assay-Ergebnisse verbietet1,7,12,13.

Präanalytische Variablen im Zusammenhang mit der Handhabung und Lagerung von Bioproben (z. B. Blutplasma, das vorübergehend bei -20 °C gehalten wird)14,15 können einen großen Einfluss auf die TBARS-Testergebnisse haben16,17; so sehr, dass TBARS-Assay-Ergebnisse nicht zwischen verschiedenen Labors verglichen werden sollten, es sei denn, dies wird durch explizite analytische Validierungsdaten zwischen den Labors gerechtfertigt. Diese Empfehlung ähnelt der Art und Weise, wie Western Blots häufig verwendet und interpretiert werden. Vergleiche der Banddichten gelten für Studien innerhalb des Blots und vielleicht innerhalb des Labors, aber der Vergleich der Banddichten zwischen Laboratorien wird im Allgemeinen als ungültige Praxis angesehen.

Einige Forscher haben vorgeschlagen, dass MDA, gemessen mit dem TBARS-Assay, einfach nicht die analytischen oder klinischen Kriterien erfüllt, die für einen akzeptablen Biomarker erforderlich sind3,9,10,18,19. In der Tat, wenn der Assay nicht vor über 50 Jahren entwickelt worden wäre, hätte er wahrscheinlich nicht die weit verbreitete Verwendung und stillschweigende Akzeptanz erlangt, die er heute hat. Obwohl es andere Assays mit größerer analytischer Sensitivität, Spezifität und Robustheit gibt, die zur Bestimmung von oxidativem Stress verwendet werden, bleibt der TBARS-Assay, der auf der Absorption bei 532 nm basiert, bei weitem einer der am häufigsten verwendeten Assays zur Bestimmung der Lipidperoxidation20 und damit zur Bewertung von oxidativem Stress.

Der TBARS-Assay ist nur als teures Kit (über 400 US-Dollar) zu finden, in dem die Anleitung keine detaillierten Informationen über die meisten Konzentrationen der verwendeten Reagenzien liefert. Darüber hinaus können die bereitgestellten Reagenzien nur für ein Experiment verwendet werden, da nur eine kolorimetrische Standardkurve pro Kit hergestellt werden kann. Dies kann für Forscher problematisch sein, die beabsichtigen, den Oxidationsgrad innerhalb weniger Proben zu verschiedenen Zeitpunkten zu bestimmen, da die gleiche Standardkurve nicht mehrmals verwendet werden kann. Daher müssen mehrere Kits für mehrere Experimente gekauft werden. Derzeit gibt es kein detailliertes Protokoll für die Durchführung eines TBARS-Assays, es sei denn, es wird ein teures Kit gekauft. Einige Forscher haben in der Vergangenheit vage beschrieben, wie man einen TBARS-Assay durchführt21,22, aber weder ein vollständig detailliertes Protokoll noch ein umfassendes Video darüber, wie man den TBARS-Assay ohne ein teures Kit durchführt, ist in der Literatur verfügbar.

Hier berichten wir über eine detaillierte, analytisch validierte Methodik zur Durchführung eines TBARS-Assays auf einfache, reproduzierbare und kostengünstige Weise. Veränderungen in der Lipidperoxidation von humanem Serum, HepG2-Lysaten und Lipoproteinen niedriger Dichte bei der Behandlung mit Cu(II)-Ionen werden als illustrative Anwendungen für den TBARS-Assay nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigen, dass dieser TBARS-Assay im Alltag konsistent und reproduzierbar ist.

Protocol

Menschliche Serumproben wurden von einwilligenden Freiwilligen unter IRB-Zulassung und gemäß den in der Deklaration von Helsinki zum Ausdruck gebrachten Prinzipien erhalten. Die Proben wurden vor dem Transfer in das Analyselabor codiert und de-identifiziert. 1. Probenvorbereitung HepG2 Zelllysate Entkernen Sie etwa 10 x 106 HepG2-Zellen pro Kolben in 16 T75-Kolben mit 14 ml EMEM-Medien, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), und züchten S…

Representative Results

Unter sauren Bedingungen (pH = 4) und bei 95 °C ergibt Malondialdehyd (MDA) bis(dimethyl acetal) MDA23. MDA und eng verwandte chemische Kongenere reagieren mit zwei Molekülen Thiobarbitursäure (TBA), um Verbindungen zu produzieren, die als Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen (TBARS) bezeichnet werden, die eine rot-rosa Farbe ergeben und eine Absorption λmax bei 532 nm aufweisen (Abbildung 1, Abbildung 2). Unter Verwendun…

Discussion

Trotz seiner Einschränkungen1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 und mangelnder Eignung für Vergleiche zwischen Laboratorien ist der TBARS-Assay einer der <…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die hier berichtete Forschung wurde zum Teil vom National Cancer Institute der National Institutes of Health unter der Award-Nr. R33 CA217702 und das Programm Initiative for Maximizing Student Development (IMSD). Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Ansicht der National Institutes of Health dar.

Materials

1x Sterile PBS pH 7.4 1 L VWR, PA 101642–262 cell lysis reagent
50 mL self-standing centrifuge tube Corning, NY CLS430897 General material
96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile Thermo Fisher Scientific, MA 280895 To measure absorbance
Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device Fisher Scientific, NH UFC510024 LDL purification
Caps for glass tubes Thermo Fisher Scientific, MA 14-930-15D for TBARS assay
Copper II Chloride SIGMA, MO 222011-250G to induce oxidation
Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm) VWR, PA 53283-800 for TBARS assay
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) ATCC, VA HB-8065 HepG2 cell media
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL eppendorf, NY 22363204 General material
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL Genesee Sceitific, CA 22363352 General material
Fetal Bovine Serum US Source Omega Scientific, CA FB-11 for cell culture
Glacial Acetic Acid SIGMA, MO 27225-1L-R TBARS Reagent
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) Thermo Scientific, MA 87786 cell lysis reagent
HEPES SIGMA, MO H3375-250G LDL solvent
HepG2 Cells ATCC, VA HB-8065 Biological matrix prototype
Hydrocloric acid (HCl) Fisher Scientific, NH A144-212 cell lysis reagent
Legend Micro 17 Centrifuge Thermo Scientific, MA 75002431 General material
Low Density Lipoprotein, Human Plasma Athens Research & Technology, GA 12-16-120412 Biological matrix prototype
Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment VWR, PA 58948-025 General material
Malondialdehyde bis (dimethyl acetal) SIGMA, MO 8207560250 TBARS Standard
Multiskan Go Microplate Spectrophotometer Fisher Scientific, NH 51119200 To measure absorbance
NP-40 EMD Millipore Corp, MA 492016-100ML cell lysis reagent
Sodium Chloride SIGMA, MO S7653-1KG cell lysis reagent
Sodium dodecyl sulfate (SDS) SIGMA, MO 436143-100G TBARS Reagent
Sodium hydroxide SIGMA, MO 367176-2.5KG TBARS Reagent
SpeedVac Concentrator Thermo Scientific, MA SC250EXP For concentrating cell lysates
T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap USA Scientific, FL 658175 cell culture
Thiobarbituric Acid SIGMA, MO T5500-100G TBARS Reagent
TRIS base Fluka, GA 93362 cell lysis reagent
Trypsin (1x) VWR, PA 16777-166 To detach HepG2 cells

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Aguilar Diaz De Leon, J., Borges, C. R. Evaluation of Oxidative Stress in Biological Samples Using the Thiobarbituric Acid Reactive Substances Assay. J. Vis. Exp. (159), e61122, doi:10.3791/61122 (2020).

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