Summary

Nöral Kök Hücrelerin Sıçan ve Fare Beynine İntra-Arteriyel Teslimatı: Serebral İskemiye Uygulama

Published: June 26, 2020
doi:

Summary

Iskemik inme sonrası yaygın karotis arter (fare) veya eksternal karotis arter (sıçan) yoluyla, enjekte çözeltileri veya süspansiyonlar için uyarlanabilir nöral kök hücreleri teslim etmek için bir yöntem bildirilmiştir. Enjekte edilen hücreler beyin parankim boyunca geniş bir şekilde dağıtılır ve doğumdan sonra 30 d’ye kadar tespit edilebilir.

Abstract

Nöral kök hücre (NSC) tedavisi inme, travmatik beyin hasarı ve nörodejeneratif bozukluklar için ortaya çıkan yenilikçi bir tedavi yöntemidir. İntrakranial doğumile karşılaştırıldığında, NSCs intra-arteriyel uygulama daha az invaziv ve beyin parankim içinde NSCs daha yaygın bir dağılım üretir. Ayrıca, intra-arteriyel doğum beyin dolaşımında ilk geçiş etkisi sağlar, periferik organlarda hücrelerin bindirme potansiyelini azaltarak, karaciğer ve dalak gibi, periferik enjeksiyonlar ile ilişkili bir komplikasyon. Burada, hem fare hem de sıçanlarda, iskemik inme sonrası ipsilateral hemisfere yaygın karotis arter (fare) veya harici karotis arter (sıçan) yoluyla NSC’lerin teslimi için metodolojiyi ayrıntılarıyla açıklıyoruz. GFP etiketli NSC’ler kullanarak, postiskemik doğumdan 1 d, 1 hafta ve 4 hafta sonra, iskemik yaralanma bölgesinin içinde veya yakınında daha yüksek yoğunlukta kemirgen ipsilateral yarımkürede elde edilen yaygın dağılımı gösteriyoruz. Uzun süreli sağkalıma ek olarak, 4 haftada GFP etiketli hücrelerin farklılaşmasına dair kanıtlar gösteriyoruz. NSC’ler için burada açıklanan intra-arteriyel doğum yaklaşımı terapötik bileşiklerin uygulanması için de kullanılabilir ve böylece birden fazla tür arasında çeşitli CNS yaralanma ve hastalık modelleri için geniş uygulanabilirlik vardır.

Introduction

Kök hücre (SC) tedavisi inme, kafa travması ve demans1,2,3,,4,5,6dahil olmak üzere nörolojik hastalıklar için bir tedavi olarak büyük bir potansiyele sahiptir. Ancak, hastalıklı beyne eksojen SCs sunmak için etkili bir yöntem sorunlu kalır2,6,7,,8,9,10,11,12,13. İntravenöz (IV) veya intraperitoneal (IP) enjeksiyonu da dahil olmak üzere periferik doğum yolları ile teslim edilen SC’ler, özellikle akciğer, karaciğer, dalak ve kas8,,9,13,14, hedef olmayan bölgelerde hücre birikimi şansını artırarak, mikrosirkülasyonda ilk geçiş filtreleme tabidir. İnvaziv intraserebral enjeksiyon yöntemi lokalize beyin dokusu hasarı ve enjeksiyon bölgesi 2 yakın SCs çok sınırlı dağılımı sonuçları2,,6,8,14,15,16. Yakın zamanda ekzojen nöral SCs (NSCs) sunmak için kateter bazlı intra-arteriyel enjeksiyon yöntemi kurduk, burada fokal iskemik inme bir kemirgen modelinde uygulanan açıklanan. Biz fare veya sıçan,17, 18,1819sol orta serebral arter (MCA) tıkamak için bir silikon kauçuk kaplı filament kullanarak bir yarımkürede geçici (1 saat) iskemi-reperfüzyon yaralanması indüklemek . Bu modelde laser Doppler veya Laser benkle,görüntüleme,17, 19,19, tutarlı nörolojik açıkları17,18,19ile ipsilateral hemisferde serebral kan akımının (CBF) yaklaşık% 75-85 depresyon tekrar gözlendi .

Zaman kazandıran amaçlar için video normal hızın iki katı hızda oynanacak şekilde ayarlanmıştır ve dikişle cilt hazırlama ve yara kapanması gibi rutin cerrahi işlemler ve motorlu şırınga pompasının kullanımı ve kurulumu sunulmamaktadır. NSC’lerin intra-arteriyel doğum yöntemi kemirgenlerde deneysel inme orta serebral arter oklüzyonu (MCAO) modeli bağlamında gösterilmiştir. Bu nedenle, ikinci ameliyatın, intra-arteriyel enjeksiyonun aynı hayvanın önceki cerrahi bölgesi kullanılarak nasıl yapıldığını göstermek için geçici iskemik inme prosedürünü de dahil ediyoruz. Kemirgen inme modellerinde intra-arteriyel NSC doğumunun fizibilitesi eksojen NSC’lerin dağılımı ve sağkalım ları değerlendirilerek gösterilmiştir. Beyin patolojisi ve nörolojik disfonksiyonu zayıflatmak için NSC tedavisinin etkinliği ayrı ayrı rapor edilecektir.

Protocol

Hayvan denelerine ilişkin tüm işlemler Kentucky Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı ve ameliyatla ilişkili stres veya ağrıyı en aza indirmek için uygun özen uygulandı. 1. Enjeksiyon kateteri ve cerrahi kancaların hazırlanması Enjeksiyon kateterini inşa edin (Şekil 1). MRE010, MRE025 ve MRE050 boru, 20 G, 26 G ve 27 G enjeksiyon iğneleri(Şekil 2A),600 kum …

Representative Results

GFP etiketli NSC’ler iskemik beyinde, çoğunlukla ipsilateral hemisferde, özellikle penumbrada ve yaralanma kenarı boyunca kolayca saptanmıştır(Şekil 6). Muayeneci görüntüleme ve analiz sırasında tek kör oldu. Örneğin, enjeksiyondan sonra 1 d’de fare hipokampusu içinde NSC saptandı. NSC’lerin bir alt kümesi, bu erken zaman noktasında bile dentat girustaki olgunlaşmamış nöron belirteci DCX’in ortak ekspresyonu göstermiştir<strong class="xfi…

Discussion

Nörolojik hastalıklar için kök hücre tedavisi hala erken bir keşif aşamasındadır. Önemli bir sorun beyne SCs veya NSCs yeterli teslim için kurulmuş bir yöntem olmasıdır.

İntravenöz (IV), intraperitoneal (IP) veya intraparenkimal/intraserebral enjeksiyon sonrası beyinde ekzojen SCS/NSC saptamasına rağmen, her doğum yaklaşımının sakıncaları vardır. Beyin içinde saptanabilir popülasyon çok düşük periferik enjeksiyon ile olduğu tahmin edilmektedir (IV veya IP), e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma aşağıdakiler tarafından desteklenmiştir: LC için AHA Ödülü 14SDG20480186, Çin Tıbbı Shanxi Üniversitesi Konu yenilik ekibi 2019-QN07 BZ için, ve Kentucky Spinal Kord ve Kafa Yaralanması Araştırma Güven hibe 14-12A KES ve LC için.

Materials

20 G needle Becton & Dickinson BD PrecisionGlide 305175 preparation of injection catheter
26 G needle Becton & Dickinson BD PrecisionGlide 305111 preparation of injection catheter
27 G needle Becton & Dickinson BD PrecisionGlide 305136 preparation of injection catheter
4-0 NFS-2 suture with needle Henry Schein Animal Health 56905 surgery
6-0 nylon suture Teleflex/Braintree Scientific 104-s surgery
Accutase STEMCELL Technologies 7922 cell detachment solution
blade Bard-Parker 10 surgery
Buprenorphine-SR Lab ZooPharm Buprenorphine-SR Lab® analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d)
Calcium/magnisum free PBS VWR 02-0119-0500 NSC dissociation
DCX antibody Millipore AB2253 immunostaining
GFAP antibody Invitrogen 180063 immunostaining
Isoflurane Henry Schein Animal Health 50562-1 surgery
MCAO filament for mouse Doccol 702223PK5Re surgery
MCAO filament for rat Doccol 503334PK5Re surgery
MRE010 catheter Braintree Scientific MRE010 preparation of injection catheter
MRE025 catheter Braintree Scientific MRE025 preparation of injection catheter
MRE050 catheter Braintree Scientific MRE050 preparation of injection catheter
Nu-Tears Ointment NuLife Pharmaceuticals Nu-Tears Ointment eye care during surgery
S&T Forceps – SuperGrip Tips JF-5TC Angled Fine Science Tools 00649-11 surgery
S&T Forceps – SuperGrip Tips JF-5TC Straight Fine Science Tools 00632-11 surgery
Superglue Pacer Technology 15187 preparation of injection catheter
syringe pump Kent Scientific GenieTouch surgery
Tuj1 antibody Millipore MAb1637 immunostaining
two-component 5 minute epoxy Devcon 20445 preparation of injection catheter
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-08 surgery
vascular clamps Fine Science Tools 00400-03 surgery
Zeiss microscope Zeiss Axio Imager 2 microscopy

References

  1. Wang, Y. Stroke research in 2017: surgical progress and stem-cell advances. The Lancet. Neurology. 17, 2-3 (2018).
  2. Bliss, T., Guzman, R., Daadi, M., Steinberg, G. K. Cell transplantation therapy for stroke. Stroke. 38, 817-826 (2007).
  3. Boese, A. C., Le, Q. E., Pham, D., Hamblin, M. H., Lee, J. P. Neural stem cell therapy for subacute and chronic ischemic stroke. Stem Cell Research & Therapy. 9, 154 (2018).
  4. Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. Customized Brain Cells for Stroke Patients Using Pluripotent Stem Cells. Stroke. 49, 1091-1098 (2018).
  5. Savitz, S. I. Are Stem Cells the Next Generation of Stroke Therapeutics. Stroke. 49, 1056-1057 (2018).
  6. Wechsler, L. R., Bates, D., Stroemer, P., Andrews-Zwilling, Y. S., Aizman, I. Cell Therapy for Chronic Stroke. Stroke. 49, 1066-1074 (2018).
  7. Muir, K. W. Clinical trial design for stem cell therapies in stroke: What have we learned. Neurochemistry International. 106, 108-113 (2017).
  8. Guzman, R., Janowski, M., Walczak, P. Intra-Arterial Delivery of Cell Therapies for Stroke. Stroke. 49, 1075-1082 (2018).
  9. Misra, V., Lal, A., El Khoury, R., Chen, P. R., Savitz, S. I. Intra-arterial delivery of cell therapies for stroke. Stem Cells and Development. 21, 1007-1015 (2012).
  10. Argibay, B., et al. Intraarterial route increases the risk of cerebral lesions after mesenchymal cell administration in animal model of ischemia. Scientific Reports. 7, 40758 (2017).
  11. Kelly, S., et al. Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11839-11844 (2004).
  12. Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. Journal of Neuroscience Research. 87, 1718-1727 (2009).
  13. Fischer, U. M., et al. Pulmonary passage is a major obstacle for intravenous stem cell delivery: the pulmonary first-pass effect. Stem Cells and Development. 18, 683-692 (2009).
  14. Misra, V., Ritchie, M. M., Stone, L. L., Low, W. C., Janardhan, V. Stem cell therapy in ischemic stroke: role of IV and intra-arterial therapy. Neurology. 79, 207-212 (2012).
  15. Muir, K. W., Sinden, J., Miljan, E., Dunn, L. Intracranial delivery of stem cells. Translational Stroke Research. 2, 266-271 (2011).
  16. Boltze, J., et al. The Dark Side of the Force – Constraints and Complications of Cell Therapies for Stroke. Frontiers in Neurology. 6, 155 (2015).
  17. Huang, C., et al. Noninvasive noncontact speckle contrast diffuse correlation tomography of cerebral blood flow in rats. Neuroimage. 198, 160-169 (2019).
  18. Wong, J. K., et al. Attenuation of Cerebral Ischemic Injury in Smad1 Deficient Mice. PLoS One. 10, 0136967 (2015).
  19. Zhang, B., et al. Deficiency of telomerase activity aggravates the blood-brain barrier disruption and neuroinflammatory responses in a model of experimental stroke. Journal of Neuroscience Research. 88, 2859-2868 (2010).
  20. Walker, T. L., Yasuda, T., Adams, D. J., Bartlett, P. F. The doublecortin-expressing population in the developing and adult brain contains multipotential precursors in addition to neuronal-lineage cells. The Journal of Neuroscience. 27, 3734-3742 (2007).
  21. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3, 20130001 (2013).
  22. Bertrand, L., Dygert, L., Toborek, M. Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  23. Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  24. Chua, J. Y., et al. Intra-arterial injection of neural stem cells using a microneedle technique does not cause microembolic strokes. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, 1263-1271 (2011).
  25. Potts, M. B., Silvestrini, M. T., Lim, D. A. Devices for cell transplantation into the central nervous system: Design considerations and emerging technologies. Surgical Neurology International. 4, 22-30 (2013).
  26. Duma, C., et al. Human intracerebroventricular (ICV) injection of autologous, non-engineered, adipose-derived stromal vascular fraction (ADSVF) for neurodegenerative disorders: results of a 3-year phase 1 study of 113 injections in 31 patients. Molecular Biology Reports. 46, 5257-5272 (2019).

Play Video

Cite This Article
Zhang, B., Joseph, B., Saatman, K. E., Chen, L. Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia. J. Vis. Exp. (160), e61119, doi:10.3791/61119 (2020).

View Video