Summary

Consegna intra-arteriosa di cellule staminali neurali al cervello di ratto e topo: applicazione all'ischemia cerebrale

Published: June 26, 2020
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Summary

Un metodo per la fornitura di cellule staminali neurali, adattabile per l’iniezione di soluzioni o sospensioni, attraverso l’arteria carotide comune (mouse) o l’arteria carotide esterna (ratto) dopo ictus ischemico è segnalato. Le cellule iniettate sono distribuite ampiamente in tutto il parenchyma cerebrale e possono essere rilevate fino a 30 d dopo la consegna.

Abstract

La terapia con cellule staminali neurali (NSC) è un trattamento innovativo emergente per ictus, lesioni cerebrali traumatiche e disturbi neurodegenerativi. Rispetto alla consegna intracranica, la somministrazione intra-arteriosa delle NSC è meno invasiva e produce una distribuzione più diffusa delle NSC all’interno del parenchyma cerebrale. Inoltre, la somministrazione intra-arteriosa consente l’effetto del primo passaggio nella circolazione cerebrale, dimezzando il potenziale di intrappolamento delle cellule negli organi periferici, come il fegato e la milza, una complicazione associata alle iniezioni periferiche. Qui, dettagliamo la metodologia, sia nei topi che nei ratti, per la consegna delle NSC attraverso l’arteria carotide comune (topo) o l’arteria carotide esterna (ratto) all’emisfero ipsilaterale dopo un ictus ischemico. Utilizzando NSC con etichetta tramite GFP, illustriamo la distribuzione diffusa ottenuta in tutto l’emisfero roditore ipsilaterale a 1 d, 1 settimana e 4 settimane dopo la consegna postischemica, con una maggiore densità all’interno o vicino al sito di lesioni ischemiche. Oltre alla sopravvivenza a lungo termine, dimostriamo di differenziare le cellule etichettate con GFP a 4 settimane. L’approccio di consegna intra-arteriosa descritto qui per le NSC può essere utilizzato anche per la somministrazione di composti terapeutici, e quindi ha un’ampia applicabilità a vari modelli di lesioni e malattie del SNC in più specie.

Introduction

La terapia con cellule staminali (SC) ha un enorme potenziale come trattamento per malattie neurologiche, tra cui ictus, trauma cranico e demenza1,2,3,4,5,6. Tuttavia, un metodo efficiente per fornire SC esogeni al cervello malato rimane problematico2,6,7,8,9,10,11,12,13.6 Le SC consegnate attraverso percorsi di consegna periferici, tra cui l’iniezione endovevenosa (IV) o intraperitoneale (IP), sono soggette a filtraggio del primo passaggio nella microcircolazione, soprattutto nei polmoni, nel fegato, nella milza e nel muscolo8,9,13,14, aumentando le probabilità di accumulo di cellule in aree non bersaglio. Il metodo invasivo di iniezione intracerebrale si traduce in danni ai tessuti cerebrali localizzati e una distribuzione molto limitata di SC vicino al sito di iniezione2,6,8,14,15,16. Recentemente abbiamo stabilito un metodo di iniezione intra-arterioso basato su catetere per fornire SC neurali esogeni (NSC), che è descritto qui applicato in un modello di roditore di ictus ischemico focale. Induciamo una lesione transiente (1 h) ischemia-reperfusione in un emisfero utilizzando un filamento rivestito in gomma di silicone per occludere l’arteria cerebrale centrale sinistra (MCA) nel topo o ratto17,18,19. In questo modello abbiamo osservato in modo riproducibile circa il 75-85% di depressione del flusso sanguigno cerebrale (CBF) nell’emisfero ipsilaterale con Laser Doppler o Laser speckle imaging17,19, producendo deficit neurologici coerenti17,18,19.

Per risparmiare tempo, il video è impostato per giocare a velocità normale e procedure chirurgiche di routine come la preparazione della pelle e la chiusura della ferita con sutura e l’uso e la configurazione della pompa siringa motorizzata non sono presentati. Il metodo di somministrazione intra-arteriale delle NSC è dimostrato nel contesto del modello di occlusione dell’arteria cerebrale centrale (MCAO) di ictus sperimentale nei roditori. Pertanto, includiamo la procedura di ictus ischemico transitorio al fine di dimostrare in seguito come il secondo intervento chirurgico, l’iniezione intra-arteriale, viene eseguita utilizzando il sito chirurgico precedente sullo stesso animale. La fattibilità della distribuzione intra-arteriale di NSC nei modelli di corsa dei roditori è dimostrata valutando la distribuzione e la sopravvivenza delle NSC esogene. L’efficacia della terapia NSC per attenuare la patologia cerebrale e la disfunzione neurologica sarà riportata separatamente.

Protocol

Tutte le procedure su soggetti animali sono state approvate dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell’Università del Kentucky, e sono state prese cure adeguate per ridurre al minimo lo stress o il dolore associato alla chirurgia. 1. Preparazione del catetere per iniezione e ganci chirurgici Costruire il catetere di iniezione (Figura 1). Raccogliere i materiali necessari tra cui: MRE010, MRE025, e MRE050 tubing, 20 G, 26 G e 27 G aghi…

Representative Results

Le NSC etichettate GFP sono state prontamente rilevate nel cervello ischemico, per lo più nell’emisfero ipsilaterale, specialmente nella penombra e lungo il bordo delle lesioni (Figura 6). L’esaminatore è stato singolo-cieco durante l’imaging e l’analisi. Ad esempio, a 1 d dopo l’iniezione, le NSC sono state rilevate all’interno dell’ippocampo del topo. Un sottoinsieme di NSC ha mostrato la co-espressione del marcatore neuronale immaturo DCX nel giro dentato anc…

Discussion

La terapia con cellule staminali per le malattie neurologiche è ancora in una fase esplorativa precoce. Un problema importante è che non esiste un metodo stabilito per la consegna sufficiente di SC o NSC nel cervello.

Anche se sC/NSC esogeni possono essere rilevati nel cervello dopo per via endovenosa (IV), intraperitoneale (IP) o iniezione intraarenchymal/intracerebrale, ogni approccio di consegna ha drawbacks. Si stima che la popolazione rilevabile all’interno del cervello sia molto bassa …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questa ricerca è stata supportata da quanto segue: AHA Award 14SDG20480186 per LC, Team di innovazione soggetto della Shanxi University of Chinese Medicine 2019-QN07 per La B , e Kentucky Spinal Cord and Head Injury Research Trust concedere 14-12A per KES e LC.

Materials

20 G needle Becton & Dickinson BD PrecisionGlide 305175 preparation of injection catheter
26 G needle Becton & Dickinson BD PrecisionGlide 305111 preparation of injection catheter
27 G needle Becton & Dickinson BD PrecisionGlide 305136 preparation of injection catheter
4-0 NFS-2 suture with needle Henry Schein Animal Health 56905 surgery
6-0 nylon suture Teleflex/Braintree Scientific 104-s surgery
Accutase STEMCELL Technologies 7922 cell detachment solution
blade Bard-Parker 10 surgery
Buprenorphine-SR Lab ZooPharm Buprenorphine-SR Lab® analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d)
Calcium/magnisum free PBS VWR 02-0119-0500 NSC dissociation
DCX antibody Millipore AB2253 immunostaining
GFAP antibody Invitrogen 180063 immunostaining
Isoflurane Henry Schein Animal Health 50562-1 surgery
MCAO filament for mouse Doccol 702223PK5Re surgery
MCAO filament for rat Doccol 503334PK5Re surgery
MRE010 catheter Braintree Scientific MRE010 preparation of injection catheter
MRE025 catheter Braintree Scientific MRE025 preparation of injection catheter
MRE050 catheter Braintree Scientific MRE050 preparation of injection catheter
Nu-Tears Ointment NuLife Pharmaceuticals Nu-Tears Ointment eye care during surgery
S&T Forceps – SuperGrip Tips JF-5TC Angled Fine Science Tools 00649-11 surgery
S&T Forceps – SuperGrip Tips JF-5TC Straight Fine Science Tools 00632-11 surgery
Superglue Pacer Technology 15187 preparation of injection catheter
syringe pump Kent Scientific GenieTouch surgery
Tuj1 antibody Millipore MAb1637 immunostaining
two-component 5 minute epoxy Devcon 20445 preparation of injection catheter
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-08 surgery
vascular clamps Fine Science Tools 00400-03 surgery
Zeiss microscope Zeiss Axio Imager 2 microscopy

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Zhang, B., Joseph, B., Saatman, K. E., Chen, L. Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia. J. Vis. Exp. (160), e61119, doi:10.3791/61119 (2020).

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