Dupla em Eletroporação utero para atingir populações celulares temporais e espacialmente separadas

O córtex cerebral é uma estrutura muito complexa e intrincadamente organizada. Para alcançar tal grau de organização, os neurônios de projeção cortical passam por processos complexos de desenvolvimento que requerem sua geração temporal, migração para seu destino final na placa cortical e o estabelecimento de conexões de curto e longo alcance^1,,2. Por muito tempo, a maneira clássica de estudar corticogênese foi baseada no uso de modelos murinos de nocaute ou knock-in de genes de interesse. No entanto, essa estratégia, e particularmente o uso de camundongos eliminatórios condicionais, é demorada e cara, e às vezes apresenta problemas adicionais quanto à existência de redundância genética ou à falta de drivers específicos de CRE, entre outras questões. Uma das abordagens que surgiram para tentar resolver esses problemas e que hoje é amplamente utilizada para estudar o desenvolvimento cortical está na eletroporação^{utero 3,4}. No útero a eletroporação é uma técnica usada para transgênese somática, permitindo o direcionamento in vivo de células-tronco neurais e sua prole. Este método pode ser usado para rotular células pela expressão de proteínas fluorescentes^5,6, para manipulação genética in vivo (ou seja, ganho ou perda de ensaios de função)^7,8,9, para isolar cortices eletroporados in vitro e cultura de células^8,,10. Além disso, no útero a eletroporação permite o controle temporal e regional da área alvo. Esta técnica possui inúmeras aplicações e tem sido amplamente utilizada para estudar migração neuronal, divisão de células-tronco, conectividade neuronal e outros sujeitos^8,,9,,11,12.

O manuscrito atual descreve o uso de uma variante de eletroporação uteral, denominada dupla em eletroporação uteral, para analisar as interações das células no córtex cerebral com diferentes origens temporais e espaciais. Esses estudos são extremamente complexos de serem concluídos ao empregar modelos murinos porque requerem o uso combinado de várias linhas transgênicas. Algumas das aplicações do protocolo descrito neste artigo incluem o estudo de interações próximas entre células vizinhas, bem como interações entre células distantes através de projeções de longo alcance. O método requer a realização de duas cirurgias de eletroporação uteral, separadas temporal e espacialmente, nos mesmos embriões para atingir diferentes populações celulares de interesse. A vantagem dessa abordagem é a possibilidade de manipular a função genética em um ou ambos os tipos de neurônios usando animais do tipo selvagem. Além disso, esses experimentos funcionais podem ser combinados com a expressão de proteínas fluorescentes citoplasmáticas ou marcadas por membrana para visualizar a morfologia fina das células-alvo, incluindo dendritos e axônios, e analisar possíveis diferenças nas interações celulares em comparação com um controle (ou seja, células apenas rotuladas com a proteína fluorescente).

O protocolo delineado aqui é focado no estudo das interações celulares dentro do neocórtex, mas essa estratégia também poderia ser usada para examinar interações com áreas extracorticais que podem ser direcionadas usando na eletroporação utero, como o subpallium ou o tálamo^13,14, ou interações célula-células em outras estruturas, como o cerebelo¹⁵. O direcionamento de diferentes áreas baseia-se na orientação dos eletrodos e no ventrículo onde o DNA é injetado (lateral, terceiro ou quarto). Com a estratégia descrita aqui, podemos rotular um número substancial de células, o que é útil para avaliar mudanças gerais na conectividade/inervação em experimentos funcionais. No entanto, para estudar mudanças finas na conectividade, pode-se usar versões modificadas de eletroporação uteróptero para obter rotulagem mais esparsa e identificar células únicas¹⁶. Em resumo, o dobro da eletroporação uteral é um método versátil que permite direcionar populações celulares temporais e espacialmente separadas e estudar suas interações em detalhes, seja em condições de controle ou combinadas com experimentos funcionais, reduzindo consideravelmente os custos temporais e econômicos.