Double électroporation in utero pour cibler les populations cellulaires séparées temporellement et spatialement

Le cortex cérébral est une structure très complexe et complexement organisée. Pour atteindre un tel degré d’organisation, les neurones de projection cortical passent par des processus développementaux complexes qui nécessitent leur génération temporelle, la migration vers leur destination finale dans la plaque corticale, et l’établissement de connexions à courte et à longue portée^1,2. Pendant longtemps, la façon classique d’étudier la corticogenèse a été basée sur l’utilisation de modèles de knock-out ou de knock-in murine de gènes d’intérêt. Toutefois, cette stratégie, et en particulier l’utilisation de souris knock-out conditionnelles, prend beaucoup de temps et coûte cher, et présente parfois des problèmes supplémentaires concernant l’existence de la redondance génétique ou l’absence de conducteurs spécifiques CRE, entre autres questions. Une des approches qui ont surgi pour essayer de résoudre ces problèmes et qui est aujourd’hui largement utilisé pour étudier le développement cortical est in utero électroporation^3,4. L’électroporation in utero est une technique utilisée pour la transgenèse somatique, permettant le ciblage in vivo des cellules souches neuronales et de leur progéniture. Cette méthode peut être utilisée pour étiqueter les cellules par l’expression des protéines fluorescentes^5,6, pour la manipulation des gènes in vivo (c.-à-d. gain ou perte d’essais de fonction)^7,8,9, pour isoler les cortices électroporated dans vitro et les cellules de culture^8,10. En outre, l’électroporation in utero permet le contrôle temporel et régional de la zone ciblée. Cette technique a de nombreuses applications et a été largement utilisé pour étudier la migration neuronale, la division des cellules souches, la connectivité neuronale, et d’autres sujets^8,9,11,12.

Le manuscrit actuel décrit l’utilisation d’une variante d’électroporation in utero, appelée double électroporation in utero, pour analyser les interactions des cellules dans le cortex cérébral avec différentes origines temporelles et spatiales. Ces études sont extrêmement complexes à compléter lorsque vous utilisez des modèles murins parce qu’ils nécessitent l’utilisation combinée de plusieurs lignes transgéniques. Certaines des applications du protocole décrites dans cet article comprennent l’étude des interactions étroites entre les cellules voisines, ainsi que les interactions entre les cellules éloignées par le biais de projections à long terme. La méthode exige l’exécution de deux chirurgies d’électroporation in utero indépendantes, séparées temporellement et spatialement, sur les mêmes embryons pour cibler différentes populations cellulaires d’intérêt. L’avantage de cette approche est la possibilité de manipuler la fonction génique dans un ou les deux types de neurones à l’aide d’animaux de type sauvage. En outre, ces expériences fonctionnelles peuvent être combinées avec l’expression de protéines fluorescentes cytoplasmiques ou membranaires pour visualiser la morphologie fine des cellules ciblées, y compris les dendrites et les axones, et analyser les différences possibles dans les interactions cellulaires par rapport à un contrôle (c.-à-d. les cellules étiquetées uniquement avec la protéine fluorescente).

Le protocole délimité ici est axé sur l’étude des interactions cellulaires à l’intérieur du néocortex, mais cette stratégie pourrait également être utilisée pour examiner les interactions avec les zones extracorticales qui peuvent être ciblées à l’aide d’électroporation in utero, comme le subpallium ou le thalamus^13,14, ou les interactions cellule-cellule dans d’autres structures, comme le cervelet¹⁵. Le ciblage de différentes zones est basé sur l’orientation des électrodes et sur le ventricule où l’ADN est injecté (latéral, troisième ou quatrième). Avec la stratégie décrite ici, nous pouvons étiqueter un nombre important de cellules, ce qui est utile pour évaluer les changements généraux dans la connectivité / innervation dans les expériences fonctionnelles. Néanmoins, pour étudier les changements fins dans la connectivité, on peut utiliser des versions modifiées de l’électroporation in utero pour obtenir l’étiquetage clairsemé et identifier les cellules simples¹⁶. En résumé, l’électroporation in utero est une méthode polyvalente qui permet de cibler les populations cellulaires séparées temporellement et spatialement et d’étudier leurs interactions en détail, soit dans des conditions de contrôle, soit combinées à des expériences fonctionnelles, réduisant considérablement les coûts temporels et économiques.