Bitki Dokularının Hücre Duvarındaki Arabinogalactan Protein ve Pektinlerin Floresan İmmünolokalizasyonu
Summary
Bu protokol, Arabinogalactan proteinlerinin ve pektinlerinin immünolokalizasyonu için bitki materyalinin hidrofilik akrilik reçineye gömülü, bölümlenmiş ve cam slaytlara monte edilmiş nasıl sabitlendiğini ayrıntılı olarak açıklar. Hücre duvarı ile ilgili epitopların spesifik antikorlarla tespit edileceğini gösteriyoruz.
Abstract
Bitki gelişimi, hem iç hem de dış uyaranlara yanıt olarak hücre duvarı bileşiminin ve yapısının sürekli olarak ayarlanmasını içerir. Hücre duvarları proteinler, fenolik bileşikler ve su ile birlikte selüloz ve selülozik olmayan polisakkaritlerden oluşur. Hücre duvarının %90’ı polisakkaritler (örneğin pektinler) ve arabinogalactan proteinlerinden (AGP) oluşur. Bitki histolojik bölümlerindeki spesifik glikan epitoplarının floresan immünolocalizasyonu, duvar polisakkarit ağlarının, yapısının ve bileşenlerinin yeniden şekillendirilmesini ortaya çıkarmak için önemli bir araç olmaya devam etmektedir.
Burada, bitki dokularındaki AGP’lerden ve pektinlerden glikan epitopları tespit etmek için optimize edilmiş bir floresan immünolocalizasyon prosedürü rapor ediyoruz. Paraformaldehit/glutaraldehit fiksasyonu, bitki örneklerinin LR-White gömülmesi ile birlikte kullanıldı ve doku yapısının ve bileşiminin daha iyi korunmasını sağladı. Ultra mikrotom ile elde edilen gömülü örneklerin ince bölümleri spesifik antikorlarla immünokokalizasyon için kullanılmıştır. Bu teknik büyük çözünürlük, yüksek özgüllük ve aynı örnekte birden fazla glikan epitop tespit etme şansı sunar. Bu teknik glikanların hücre altı lokalizasyonunu sağlar ve hücre duvarındaki birikim düzeylerini algılar. Ayrıca gelişimsel süreçler sırasında AGP ve pektin dağılımının mekansal-zamansal paternlerinin belirlenmesine izin sağlar. Bu aracın kullanımı sonuçta araştırma yönlerine rehberlik edebilir ve glikanları bitkilerdeki belirli işlevlere bağlayabilir. Ayrıca elde edilen bilgiler biyokimyasal ve gen ekspresyon çalışmalarını tamamlayabilir.
Introduction
Bitki hücre duvarları polisakkaritler ve glikoproteinlerden oluşan karmaşık yapılardır. Hücre duvarları, mimarisi, organizasyonu ve bileşimi hücre tipine, lokalizasyona, gelişim aşamasına, dış ve iç uyaranlara göre değişen son derece dinamik yapılardır1. Arabinogalactan proteinleri (AGP’ler) ve pektinler bitki hücre duvarının önemli bileşenleridir. AGP’ler oldukça glikosillenmiş proteinlerdir ve pektinler, farklı bitki gelişim aşamalarında bileşimi, miktarı ve yapısı büyük ölçüde değişen homogalacturonan polisakkaritlerdir2,3,4. AGP’ler ve pektin çalışmaları, programlanmış hücre ölümü,biyotik streslere yanıt, cinsel bitki üremesi gibi çeşitli bitki süreçlerinde rollerini ortaya koydu5. Bu çalışmaların çoğu immünolokalizasyon çalışmalarından elde edilen bilgilerle başlamıştır.
Karmaşıklığı göz önüne alındığında, hücre duvarlarının incelenmesi birçok farklı araç gerektirir. Glikan epitoplarının monoklonal antikorlar (mAbs) kullanılarak saptanması, bu yapı boyunca polisakkarit ve glikoprotein dağılımını çözmek için değerli bir yaklaşımdır. Glikan epitoplarını tespit etmek için geniş bir mAb koleksiyonu vardır ve her mAb’nin özgüllüğü sürekli olarak iyileştirilmektedir6. Burada açıklanan teknik tüm bitki türleri için geçerlidir ve daha pahalı ve karmaşık teknikler içerebilecek gelecekteki araştırma yönlerine rehberlik etmek için mükemmel bir araçtır.
Bu teknikte spesifik antikorlar FITC (floresan izotiyosiyanat), TRITC (tetrametrinhodamin-5-(ve 6)-izotiyosiyanat) veya birkaç Alexa Fluor boyası gibi floresan boyalara kimyasal olarak konjuge edilir. İmmünoresans, floresan mikroskobu altında doğrudan gözlemlenebilen glikanların net ve hızlı bir hücre altı lokalizasyonuna izin veren çeşitli avantajlar sunar. Son derece spesifik ve hassastır, çünkü numunenin hazırlanması, daha düşük miktarlarda mevcut olsa bile antijenin doğal yapısını etkili bir şekilde koruyabilir. Aynı örnekte ve en önemlisi birden fazla antijenin tespit edilmesine izin verir, yüksek kaliteli ve görsel olarak güzel sonuçlar sunar. Floresan immünolocalizasyon çalışmalarının sunduğu büyük güce rağmen, genellikle prosedürün farklı adımlarının görselleştirilmesine izin eden ayrıntılı protokollerin olmaması nedeniyle yapılması ve uygulanması zor olarak kabul edilirler. Burada, bu tekniğin nasıl gerçekleştirilacağı ve yüksek kaliteli görüntülerin nasıl eldeılacağı hakkında bazı basit yönergeler sunuyoruz.
Burada sunulan protokol için, örneklerin öncelikle en uygun sabitleyici kullanılarak sabitlenilmesi ve gömülmesi gerekir. Zaman alıcı ve nispeten sıkıcı bir teknik olarak düşünülse de, bitki örneğinin uygun şekilde sabitlenmesi ve gömülmesi, başarılı bir immünolocalizasyon tahlilini sağlamanın anahtarıdır. Bu amaçla, en olağan olanı aldehitler gibi çapraz bağlama fiksatifleri kullanılarak kimyasal fiksasyondur. Çapraz bağlama fiksatifleri, doku molekülleri arasında kimyasal bağlar kurarak numuneyi stabilize eder ve sertleşir. Formaldehit ve glutaraldehit, fiksatifleri çapraz bağlar ve bazen her iki fiksatifin bir karışımı kullanılır7. Formaldehit, dokuların ve uzun sürelerin büyük yapısal korunmasını, küçük doku geri çekilmeleri üretilmesini ve immünostaining ile uyumlu olmasını sunar. Glutaraldehit, genellikle formaldehit ile birlikte kullanılan daha güçlü ve kararlı bir fiksatiftir. Glutaraldehit kullanımı, bazı serbest aldehit gruplarını sabit dokuya soktuğu için dikkate alınması gereken bazı dezavantajlara sahiptir, bu da bazı belirsiz etiketlemeler oluşturabilir. Ayrıca proteinler ve diğer moleküller arasındaki çapraz bağlantı bazen bazı hedef epitopları antikorlar için erişilemez hale getirebilir. Bunu önlemek için, fiksasyonun miktarı ve süresi dikkatlice tanımlanmalıdır.
Sabitlemeden sonra, numuneler bölümleri elde etmeden önce sertleştirmek için uygun reçineye gömülür. Londra Reçinesi (LR-White) akrilik reçine, immünolokalizasyon çalışmaları için tercih edilmesi olan reçinedir. Diğer reçinelerin aksine, LR-White hidrofiliktir ve antikorların antijenlerine ulaşmasını sağlar ve bunu kolaylaştırmak için herhangi bir tedaviye gerek yoktur. LR-White ayrıca düşük otomatik floresan sunma avantajına sahiptir ve immünoresans görüntülemesi sırasında arka plan gürültüsünde bir azalma sağlar.
Alcian mavisi boyama, toluidin mavisi boyama veya Periyodik asit-Schiff (PAS) lekeleme gibi hücre duvarının farklı bileşenlerini tespit etmek için birçok boyama tekniği mevcuttur. Bunların hiçbiri immünolokalizasyon analizlerinin gücünü sunmaz8. Bu yaklaşım glikanların tespitinde daha fazla özgüllük sağlar ve hücre duvarı bileşimi ve yapısı hakkında daha geniş bilgiler sunar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan bitkilerdeki floresan immünolocalizasyon yöntemi, sorunsuz bir şekilde basit olsa da, birkaç küçük adımın başarısına dayanır. Bunlardan ilki örnek hazırlama ve sabitlemedir. Bu ilk adım sırasında, hücre bileşenlerinin çoğunu çapraz bağlamak için formaldehit ve glutaraldehit karışımı kullanılır. Çözeltideki formaldehit hafif ve geri dönüşümlü bir fiksasyon sağlarken glutaraldehit daha kalıcı güçlü bir bağlantı sağlar; iki fiksatif arasındaki denge, epitopl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, H2020-MSCA-RISE-2015 ve SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017 tarafından finanse edilen AB projesi 690946 ‘SexSeed’ (Cinsel Bitki Üretimi – Tohum Oluşumu) tarafından destek aldı. AMP, Avrupa Birliği’nin MSCA-IF-2016 projesinden (no. 753328) hibe aldı. MC, FCT PhD hibesi SFRH/BD/111781/2015’ten hibe aldı.
Materials
| 25% (w/v) Gluteraldehyde | Agar Scientific | AGR1010 | aq. Solution, methanol free |
| 8 wells Glass reaction slides | Marinfeld | MARI1216750 | other brands may be used |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT | Sigma-Aldrich | F6258 | |
| cover slips, 24 mm x 50 mm | Marinfeld | MARI0100222 | The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used |
| ddH2O | na | na | |
| Ethanol absolute | na | na | |
| Fluorescent brightner 28 | Sigma-Aldrich | F-6259 | |
| Gelatin capsules | Agar scientific | AGG29211 | The capsule size sould feat the size of the sample. |
| Glass vials | na | na | Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused. |
| LR-white medium grade, embdeding resin | Agar Scientific | AGR1281 | LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin. |
| Non fat dry milk | Nestlé | na | any non fat dry milk is adequate |
| Oven | na | na | generic laboratory oven |
| Petri dish, 10 cm x 10 cm square | na | na | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Rat generated Monoclonal Anti-Body | Plant probes | na | Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1 |
| Razor blades | na | na | regular razor blades |
| SDS | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Toluidine Blue-O | Agar Scientific | AGR1727 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC7 | |
| upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters | Leica Mycrosistems | DMLb | |
| vaccum chamber | na | na | |
| vaccum pump | na | na | |
| Vectashield | vecta Labs | T-1000 | Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.) |
References
- Keegstra, K. Plant Cell Walls. Plant Physiology. 154 (2), 483-486 (2010).
- Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues. Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).
- Showalter, A. Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).
- Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development. Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).
- Seifert, G., Roberts, K. The biology of arabinogalactan proteins. Annual Review of Plant Biology. 58, 137-161 (2007).
- Ruprecht, C., et al. A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies. Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).
- Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy. Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505 (2017).
- Osborn, M., Weber, K. Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures. Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).
- Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction. Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).
- Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).
- Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto. Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).
- Coimbra, S., Salema, R. Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules. Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).
- Coimbra, S., Duarte, C. Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus. Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).
- El-Tantawy, A., et al. Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus. Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).
- Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae). Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).
- Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis. Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).
- Hibbs, A. R. Fluorescence Immunolabelling. Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).
- Johnson, G. D., et al. Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy. Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).
- Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors. Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).
- Weber, G. F., Menko, A. S. Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes. BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).
