Fluorescerende immunolocalisatie van Arabinogalactan-eiwitten en pectines in de celwand van plantenweefsels
Summary
Dit protocol beschrijft in detail hoe het plantaardige materiaal voor immunolocalisatie van Arabinogalactan-eiwitten en pectines is bevestigd, ingebed in een hydrofiele acrylhars, doorsneden en gemonteerd op glazen dia’s. We laten zien dat celwandgerelateerde epitopen worden gedetecteerd met specifieke antilichamen.
Abstract
Plantontwikkeling omvat constante aanpassingen van de celwandsamenstelling en structuur als reactie op zowel interne als externe stimuli. Celwanden bestaan uit cellulose en niet-cellulosepolysachariden samen met eiwitten, fenolverbindingen en water. 90% van de celwand bestaat uit polysachariden (bijv. pectines) en arabinogalactan-eiwitten (APP’s). De fluorescerende immunolocalisatie van specifieke glycanepotopen in histologische secties van planten blijft een belangrijk hulpmiddel om de renovatie van wandpolysaccharidenetwerken, structuur en componenten te ontdekken.
Hier rapporteren we een geoptimaliseerde fluorescerende immunolocalisatieprocedure om glycanepotopen van APP’s en pectines in plantenweefsels te detecteren. Paraformaldehyde/glutaraldehyde fixatie werd gebruikt samen met LR-White inbedding van de plantenmonsters, waardoor een betere conservering van de weefselstructuur en samenstelling mogelijk was. Dunne delen van de ingebedde monsters verkregen met een ultra-microtome werden gebruikt voor immunolocalisatie met specifieke antilichamen. Deze techniek biedt een hoge resolutie, hoge specificiteit en de kans om meerdere glycan epitopen in hetzelfde monster te detecteren. Deze techniek maakt subcellulaire lokalisatie van glycanen mogelijk en detecteert hun accumulatieniveau in de celwand. Het maakt ook de bepaling van spatio-temporele patronen van AGP en pectineverdeling tijdens ontwikkelingsprocessen mogelijk. Het gebruik van deze tool kan uiteindelijk leidend zijn voor onderzoeksrichtingen en glycanen koppelen aan specifieke functies in planten. Bovendien kan de verkregen informatie een aanvulling vormen op biochemische en genexpressiestudies.
Introduction
Plantencelwanden zijn complexe structuren die bestaan uit polysachariden en glycoproteïnen. Celwanden zijn uiterst dynamische structuren waarvan de architectuur, organisatie en samenstelling variëren afhankelijk van celtype, lokalisatie, ontwikkelingsfase, externe en interne stimuli1. Arabinogalactan-eiwitten (APP’s) en pectines zijn belangrijke componenten van de plantencelwand. APP ‘s zijn sterk geglycosyleerde eiwitten en pectines zijn homogalacturonan polysachariden waarvan de samenstelling, hoeveelheid en structuur sterk variëren tijdens verschillende ontwikkelingsstadia2,3,4. ASP’s en pectinestudies hebben hun betrokkenheid bij verschillende plantprocessen aan het licht gebracht, zoals geprogrammeerde celdood, reactie op abiotische stress, seksuele plantenreproductie, en vele anderen5. De meeste van deze studies begonnen met informatie verkregen uit immunolocalisatiestudies.
Gezien de complexiteit vereist de studie van celwanden veel verschillende hulpmiddelen. Detectie van glycan epitopen met behulp van monoklonale antilichamen (mAbs) is een waardevolle aanpak om polysaccharide en glycoproteïne distributie langs deze structuur op te lossen. Er is een grote verzameling mAbs beschikbaar om glycan epitopen te detecteren en de specificiteit van elke mAb wordt ook voortdurend verbeterd6. De hier beschreven techniek is toepasbaar op alle plantensoorten en is een perfect hulpmiddel om toekomstige onderzoeksrichtingen te sturen die duurdere en complexere technieken met zich mee kunnen brengen.
In deze techniek worden specifieke antilichamen chemisch geconjugeerd aan fluorescerende kleurstoffen zoals FITC (fluoresceïne-isothiocyanaat), TRITC (tetramethylrhodamine-5-(en 6)-isothiocyanaat) of verschillende Alexa Fluorkleurstoffen. Immunofluorescentie biedt verschillende voordelen, waardoor een duidelijke en snelle subcellulaire lokalisatie van glycanen mogelijk is die direct kan worden waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop. Het is zeer specifiek en gevoelig, omdat de bereiding van het monster de natuurlijke structuur van het antigeen effectief kan beschermen, zelfs als het in lagere hoeveelheden aanwezig is. Het maakt de detectie van meerdere antigenen in hetzelfde monster mogelijk en het belangrijkste, biedt hoge kwaliteit en visueel mooie resultaten. Ondanks de grote kracht die wordt geboden door fluorescentie-immunolocalisatiestudies, worden ze vaak beschouwd als moeilijk uit te voeren en te implementeren, waarschijnlijk vanwege het ontbreken van gedetailleerde protocollen die de visualisatie van de verschillende stappen van de procedure mogelijk maken. Hier geven we enkele eenvoudige richtlijnen voor het uitvoeren van deze techniek en het verkrijgen van afbeeldingen van hoge kwaliteit.
Voor het protocol dat hier wordt gepresenteerd, moeten monsters eerst worden bevestigd en ingesloten met behulp van het meest geschikte fixatieve. Hoewel beschouwd als een tijdrovende en relatief vervelende techniek, is een goede fixatie en inbedding van het plantenmonster de sleutel om een succesvolle immunolocalisatietest te garanderen. Voor dit doel is chemische fixatie het meest gebruikelijk met behulp van crosslinking-fixatieven, zoals aldehyden. Cross-linking fixatieven vestigen chemische bindingen tussen moleculen van het weefsel, stabiliseren en verharden van het monster. Formaldehyde en glutaraldehyde zijn cross-linking fixatieven, en soms wordt een mix van beide fixatieven gebruikt7. Formaldehyde biedt een grote structurele conservering van weefsels en voor langere tijd, produceert kleine weefsel retracties en is compatibel met immunostaining. Glutaraldehyde is een sterker en stabiel fixatief dat meestal wordt gebruikt in combinatie met formaldehyde. Het gebruik van glutaraldehyde heeft enkele nadelen waarmee rekening moet worden gehouden, omdat het enkele vrije aldehydegroepen in het vaste weefsel introduceert, wat een aantal niet-specifieke etikettering kan genereren. Ook het kruisen tussen eiwitten en andere moleculen kan af en toe sommige doeleptopen ontoegankelijk maken voor de antilichamen. Om dit te voorkomen, moeten de hoeveelheid en duur van de fixatie zorgvuldig worden gedefinieerd.
Na fixatie worden monsters ingebed in de juiste hars om uit te harden voordat de secties worden verkregen. London Resin (LR-White) acrylhars is de hars bij uitstek voor immunolokalisatiestudies. In tegenstelling tot andere harsen is LR-White hydrofiel, waardoor de antilichamen hun antigenen kunnen bereiken, zonder dat er een behandeling nodig is om het te vergemakkelijken. LR-White heeft ook het voordeel dat het een lage autofluorescentie biedt, waardoor achtergrondgeluid tijdens immunofluorescentiebeeldvorming kan worden verkleind.
Er zijn veel kleuringstechnieken beschikbaar om verschillende componenten van de celwand te detecteren, zoals Alcaanse blauwe kleuring, toluidineblauwe kleuring of Periodieke acid-Schiff (PAS) kleuring. Geen van deze biedt de kracht van immunolocalisatieanalyses8. Deze aanpak geeft meer specificiteit in de detectie van glycanen en biedt uitgebreidere informatie over de samenstelling en structuur van de celwand.
Protocol
Representative Results
Discussion
De fluorescerende immunolocalisatiemethode in planten hier beschreven, hoewel naadloos eenvoudig, is gebaseerd op het succes van verschillende kleine stappen. De eerste is monstervoorbereiding en fixatie. Tijdens deze eerste stap wordt een mengsel van formaldehyde en glutaraldehyde gebruikt om de meerderheid van de celcomponenten te kruisen. De formaldehyde in de oplossing zorgt voor een milde en omkeerbare fixatie, terwijl de glutaraldehyde een sterke, meer permanente koppeling biedt; het evenwicht tussen de twee fixati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs ontvingen steun van het EU-project 690946 ‘SexSeed’ (Sexual Plant Reproduction – Seed Formation) gefinancierd door H2020-MSCA-RISE-2015 en SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017. AMP ontving een subsidie van het MSCA-IF-2016-project van de Europese Unie (nr. 753328). MC ontving een subsidie van FCT PhD grant SFRH/BD/111781/2015.
Materials
| 25% (w/v) Gluteraldehyde | Agar Scientific | AGR1010 | aq. Solution, methanol free |
| 8 wells Glass reaction slides | Marinfeld | MARI1216750 | other brands may be used |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT | Sigma-Aldrich | F6258 | |
| cover slips, 24 mm x 50 mm | Marinfeld | MARI0100222 | The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used |
| ddH2O | na | na | |
| Ethanol absolute | na | na | |
| Fluorescent brightner 28 | Sigma-Aldrich | F-6259 | |
| Gelatin capsules | Agar scientific | AGG29211 | The capsule size sould feat the size of the sample. |
| Glass vials | na | na | Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused. |
| LR-white medium grade, embdeding resin | Agar Scientific | AGR1281 | LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin. |
| Non fat dry milk | Nestlé | na | any non fat dry milk is adequate |
| Oven | na | na | generic laboratory oven |
| Petri dish, 10 cm x 10 cm square | na | na | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Rat generated Monoclonal Anti-Body | Plant probes | na | Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1 |
| Razor blades | na | na | regular razor blades |
| SDS | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Toluidine Blue-O | Agar Scientific | AGR1727 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC7 | |
| upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters | Leica Mycrosistems | DMLb | |
| vaccum chamber | na | na | |
| vaccum pump | na | na | |
| Vectashield | vecta Labs | T-1000 | Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.) |
References
- Keegstra, K. Plant Cell Walls. Plant Physiology. 154 (2), 483-486 (2010).
- Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues. Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).
- Showalter, A. Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).
- Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development. Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).
- Seifert, G., Roberts, K. The biology of arabinogalactan proteins. Annual Review of Plant Biology. 58, 137-161 (2007).
- Ruprecht, C., et al. A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies. Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).
- Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy. Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505 (2017).
- Osborn, M., Weber, K. Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures. Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).
- Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction. Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).
- Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).
- Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto. Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).
- Coimbra, S., Salema, R. Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules. Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).
- Coimbra, S., Duarte, C. Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus. Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).
- El-Tantawy, A., et al. Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus. Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).
- Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae). Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).
- Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis. Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).
- Hibbs, A. R. Fluorescence Immunolabelling. Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).
- Johnson, G. D., et al. Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy. Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).
- Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors. Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).
- Weber, G. F., Menko, A. S. Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes. BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).
