Флуоресцентная иммунолокализация арабиногалактических белков и пектинов в клеточной стенке тканей растений
Summary
Этот протокол подробно описывает, как фиксируется растительный материал для иммунолокализации арабиногалактановых белков и пектинов, встроенный в гидрофильные акриловые смолы, секционированные и установленные на стеклянных слайдах. Мы показываем, что эпитопы, связанные с клеточной стеной, будут обнаружены с помощью специфических антител.
Abstract
Развитие растений включает в себя постоянную корректировку состава и структуры клеточной стенки в ответ как на внутренние, так и на внешние раздражители. Клеточные стенки состоят из целлюлозы и неклеточных полисахаридов вместе с белками, фенольными соединениями и водой. 90% клеточной стенки состоит из полисахаридов (например, пектинов) и арабиногалактановых белков (АГП). Флуоресцентная иммунолокализация специфических гликан-эпитопов в гистологических секциях растений остается ключевым инструментом для обнаружения ремоделирования стеночных полисахаридных сетей, структуры и компонентов.
Здесь мы сообщаем об оптимизированной флуоресцентной процедуре иммунолокализации для обнаружения эпитопов гликанов из АЛП и пектинов в тканях растений. Параформальдегид/глутаралдегид фиксация была использована вместе с LR-White встраивания образцов растений, что позволяет лучше сохранить структуру ткани и состава. Тонкие секции встроенных образцов, полученных с помощью ультрамистома, использовались для иммунолокализации специфическими антителами. Этот метод предлагает отличное разрешение, высокую специфичность и возможность обнаружения нескольких гликан-эпитопов в одном образце. Этот метод позволяет субклеточной локализации гликанов и обнаруживает их уровень накопления в клеточной стенке. Это также позволяет определить пространственно-временные модели AGP и распределения пектина в процессах развития. Использование этого инструмента может в конечном итоге направлять направления исследований и связывать гликаны с конкретными функциями растений. Кроме того, полученная информация может дополнять биохимические исследования и исследования экспрессии генов.
Introduction
Стенки клеток растений являются сложными структурами, состоящими из полисахаридов и гликопротеинов. Клеточные стены являются чрезвычайно динамичными структурами, архитектура, организация и состав которых варьируются в зависимости от типа клетки, локализации, стадии развития, внешних и внутреннихстимулов 1. Арабиногалактановые белки (АГП) и пектины являются важными компонентами стенки клеток растений. AGPs высоко гликозилированных белков и пектинов гомогалактуронных полисахаридов, состав, количество и структура которых сильно различаются на различныхстадиях развития растений 2,3,4. AGPs и исследования пектина показали их участие в нескольких процессах завода, таких как запрограммированная гибель клеток, ответ на абиотические стрессы, половое размножение растений, среди многихдругих 5. Большинство из этих исследований началось с информации, полученной в результате исследований иммунолокализации.
Учитывая его сложность, изучение клеточных стенок требует много различных инструментов. Обнаружение гликановых эпитопов с использованием моноклональных антител (мабов) является ценным подходом к разрешению распределения полисахаридов и гликопротеинов вдоль этой структуры. Существует большая коллекция mAbs доступны для обнаружения гликан эпитопов и специфика каждого mAb постоянно совершенствуется, атакже 6. Описанная здесь методика применима ко всем видам растений и является идеальным инструментом для руководства будущими направлениями исследований, которые могут включать более дорогостоящие и сложные методы.
В этом методе, специфические антитела химически конъюгируются к флуоресцентным красителям such as FITC (фторсейн изотиоцианат), TRITC (тетраметилдодамин-5-(и 6)-isothiocyanate) или несколько красителей Alexa Fluor. Иммунофлуоресценция предлагает ряд преимуществ, что позволяет четко и быстро субклеточной локализации гликанов, которые могут быть непосредственно замечены под флуоресцентным микроскопом. Он очень специфичен и чувствителен, так как подготовка образца может эффективно защитить естественную структуру антигена, даже если присутствует в меньшем количестве. Это позволяет обнаруживать несколько антигенов в одном образце и, самое главное, предлагает высокое качество и визуально красивые результаты. Несмотря на большую мощность, предлагаемую исследованиями иммунолокализации флуоресценции, они часто считаются трудными для выполнения и реализации, скорее всего, из-за отсутствия подробных протоколов, позволяющих визуализировать различные этапы процедуры. Здесь мы предоставляем несколько простых рекомендаций о том, как выполнить эту технику и как получить высококачественные изображения.
Для протокола, представленного здесь, образцы должны быть сначала исправлены и встроены с использованием наиболее подходящего фиксатора. Хотя считается трудоемким и относительно утомительным методом, надлежащая фиксация и встраивание образца растения является ключом к обеспечению успешного анализа иммунолокализации. Для этой цели наиболее обычной является химическая фиксация с использованием перекрестных фиксаторов, таких как альдегиды. Перекрестные фиксаторы устанавливают химические связи между молекулами ткани, стабилизируют и затвердевают образец. Формальдегид и глутаралдегид являются перекрестными фиксаторами, и иногда используется сочетание обоих фиксаторов7. Формальдегид предлагает большое структурное сохранение тканей и в течение длительных периодов времени, производя небольшие опровержения тканей и быть совместимым с иммуностимулированием. Glutaraldehyde является более сильным и стабильным фиксатор обычно используется в сочетании с формальдегидом. Использование глутаралдегид имеет некоторые недостатки, которые должны быть приняты во внимание, как он вводит некоторые свободные группы альдегида в фиксированной ткани, которые могут генерировать некоторые неспецифические маркировки. Кроме того, перекрестные связи между белками и другими молекулами иногда может сделать некоторые целевые эпитопы недоступными для антител. Чтобы избежать этого, количество и продолжительность фиксации должны быть тщательно определены.
После фиксации образцы встраиваются в правильную смолу, чтобы затвердеть перед получением секций. Лондонская смола (LR-White) акриловая смола является смолой выбора для иммунолокализации исследований. В отличие от других смол, LR-белый является гидрофильной, что позволяет антителам достичь своих антигенов, без необходимости какого-либо лечения, чтобы облегчить его. LR-White также имеет преимущество, предлагая низкую аутофлуоресценцию, что позволяет снижение фонового шума во время иммунофлуоресценции изображения.
Есть много методов окрашивания доступны для обнаружения различных компонентов клеточной стенки, таких как Alcian синий окрашивания, толуйдин синий окрашивания или периодические кислоты Шифф (PAS) окрашивания. Ни один из них не предлагает силу иммунолокализации анализы8. Такой подход дает большую специфичность в обнаружении гликанов, предлагая более обширную информацию о составе и структуре клеточной стенки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод флуоресцентной иммунолокализации растений, описанный здесь, хотя и легко прост, опирается на успех нескольких небольших шагов. Первым из них является подготовка и фиксация образца. Во время этого первого шага, смесь формальдегида и глутаралдегида используется для перекрестного …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы получили поддержку от проекта ЕС 690946 ‘SexSeed’ (Сексуальная репродукция растений – Формирование семян), финансируемого H2020-MSCA-RISE-2015 и SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017. AMP получила грант от проекта MSCA-IF-2016 Европейского союза (No 753328). МК получил грант от FCT PhD грант SFRH/BD/111781/2015.
Materials
| 25% (w/v) Gluteraldehyde | Agar Scientific | AGR1010 | aq. Solution, methanol free |
| 8 wells Glass reaction slides | Marinfeld | MARI1216750 | other brands may be used |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT | Sigma-Aldrich | F6258 | |
| cover slips, 24 mm x 50 mm | Marinfeld | MARI0100222 | The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used |
| ddH2O | na | na | |
| Ethanol absolute | na | na | |
| Fluorescent brightner 28 | Sigma-Aldrich | F-6259 | |
| Gelatin capsules | Agar scientific | AGG29211 | The capsule size sould feat the size of the sample. |
| Glass vials | na | na | Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused. |
| LR-white medium grade, embdeding resin | Agar Scientific | AGR1281 | LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin. |
| Non fat dry milk | Nestlé | na | any non fat dry milk is adequate |
| Oven | na | na | generic laboratory oven |
| Petri dish, 10 cm x 10 cm square | na | na | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Rat generated Monoclonal Anti-Body | Plant probes | na | Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1 |
| Razor blades | na | na | regular razor blades |
| SDS | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Toluidine Blue-O | Agar Scientific | AGR1727 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC7 | |
| upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters | Leica Mycrosistems | DMLb | |
| vaccum chamber | na | na | |
| vaccum pump | na | na | |
| Vectashield | vecta Labs | T-1000 | Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.) |
References
- Keegstra, K. Plant Cell Walls. Plant Physiology. 154 (2), 483-486 (2010).
- Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues. Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).
- Showalter, A. Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).
- Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development. Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).
- Seifert, G., Roberts, K. The biology of arabinogalactan proteins. Annual Review of Plant Biology. 58, 137-161 (2007).
- Ruprecht, C., et al. A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies. Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).
- Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy. Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505 (2017).
- Osborn, M., Weber, K. Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures. Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).
- Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction. Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).
- Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).
- Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto. Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).
- Coimbra, S., Salema, R. Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules. Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).
- Coimbra, S., Duarte, C. Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus. Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).
- El-Tantawy, A., et al. Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus. Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).
- Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae). Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).
- Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis. Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).
- Hibbs, A. R. Fluorescence Immunolabelling. Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).
- Johnson, G. D., et al. Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy. Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).
- Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors. Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).
- Weber, G. F., Menko, A. S. Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes. BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).
