Inmunolocalización fluorescente de proteínas arabinogalactanas y pectinas en la pared celular de los tejidos vegetales
Summary
Este protocolo describe en detalle cómo se fija el material vegetal para la inmunolocalización de proteínas y pectinas arabinogalactanas, incrustado en una resina acrílica hidrófila, seccionado y montado en toboganes de vidrio. Mostramos que los epítopos relacionados con la pared celular se detectarán con anticuerpos específicos.
Abstract
El desarrollo de la planta implica ajustes constantes de la composición y estructura de la pared celular en respuesta a estímulos internos y externos. Las paredes celulares se componen de celulosa y polisacáridos no celulósicos junto con proteínas, compuestos fenólicos y agua. El 90% de la pared celular se compone de polisacáridos (por ejemplo, pectinas) y proteínas arabinogalactanas (AGPs). La inmunolocalización fluorescente de epítopos glicanos específicos en secciones histológicas vegetales sigue siendo una herramienta clave para descubrir la remodelación de redes, estructura y componentes de polisacáridos de pared.
Aquí, informamos de un procedimiento optimizado de inmunolocalización fluorescente para detectar epitopos glicanos de AGPs y pectinas en tejidos vegetales. Se utilizó la fijación de paraformaldehído/glutaraldehído junto con la incrustación LR-White de las muestras de la planta, lo que permite una mejor preservación de la estructura y composición del tejido. Secciones delgadas de las muestras incrustadas obtenidas con un ultra-microtome se utilizaron para la inmunolocalización con anticuerpos específicos. Esta técnica ofrece una gran resolución, alta especificidad y la posibilidad de detectar múltiples epítopos glicanos en la misma muestra. Esta técnica permite la localización subcelular de glicanos y detecta su nivel de acumulación en la pared celular. También permite la determinación de patrones espacio-temporales de distribución de AGP y pectina durante los procesos de desarrollo. El uso de esta herramienta puede, en última instancia, guiar las instrucciones de investigación y vincular glicanos a funciones específicas en las plantas. Además, la información obtenida puede complementar estudios bioquímicos y de expresión génica.
Introduction
Las paredes de células vegetales son estructuras complejas compuestas de polisacáridos y glicoproteínas. Las paredes celulares son estructuras extremadamente dinámicas cuya arquitectura, organización y composición varían según el tipo de celda, localización, etapa de desarrollo, estímulos externos e internos1. Las proteínas arabinogalactan (AGPs) y las pectinas son componentes importantes de la pared celular vegetal. Los AGPs son proteínas y pectinas altamente glicosiladas son polisacáridos homogalacturonan cuya composición, cantidad y estructura varían mucho durante diferentes etapas de desarrollo vegetal2,3,4. Agps y estudios de pectina han revelado su participación en varios procesos vegetales como la muerte celular programada, respuesta a tensiones abióticas, reproducción de plantas sexuales, entre muchos otros5. La mayoría de estos estudios comenzaron con información obtenida de estudios de inmunolocalización.
Dada su complejidad, el estudio de las paredes celulares requiere muchas herramientas diferentes. La detección de epítopos glicanos utilizando anticuerpos monoclonales (mAbs) es un enfoque valioso para resolver la distribución de polisacáridos y glicoproteínas a lo largo de esta estructura. Hay una gran colección de mAbs disponibles para detectar epítopos glicanos y la especificidad de cada mAb se está mejorando continuamente, así como6. La técnica aquí descrita es aplicable a todas las especies vegetales, y es una herramienta perfecta para guiar futuras direcciones de investigación que podrían implicar técnicas más costosas y complejas.
En esta técnica, anticuerpos específicos se conjugan químicamente a tintes fluorescentes como FITC (isothiocyanato de fluoresceína), TRITC (tetrametilrhodamina-5-(y 6)-isothiocyanato) o varios tintes Alexa Fluor. La inmunofluorescencia ofrece varias ventajas, permitiendo una localización subcelular clara y rápida de glicanos que se pueden observar directamente bajo un microscopio de fluorescencia. Es altamente específico y sensible, ya que la preparación de la muestra puede proteger eficazmente la estructura natural del antígeno, incluso si está presente en cantidades más bajas. Permite la detección de múltiples antígenos en la misma muestra y lo más importante, ofrece resultados de alta calidad y visualmente hermosos. A pesar de la gran potencia que ofrecen los estudios de inmunolocalización de fluorescencia, a menudo se consideran difíciles de realizar e implementar muy probablemente debido a la falta de protocolos detallados que permitan la visualización de los diferentes pasos del procedimiento. Aquí, proporcionamos algunas directrices simples sobre cómo realizar esta técnica y cómo obtener imágenes de alta calidad.
Para el protocolo presentado aquí, las muestras primero deben ser fijas e incrustadas utilizando el fijador más adecuado. Aunque se considera como una técnica lenta y relativamente tediosa, la fijación e incrustación adecuada de la muestra vegetal es la clave para garantizar un ensayo de inmunolocalización exitoso. Para ello, lo más habitual es la fijación química mediante fijadores de enlace cruzado, como los aldehídos. Los fijadores de enlace cruzado establecen vínculos químicos entre moléculas del tejido, estabilizando y endureciendo la muestra. Formaldehído y glutaraldehído son fijadores de enlace cruzado, y a veces se utiliza una mezcla de ambos fijadores7. El formaldehído ofrece una gran preservación estructural de los tejidos y durante largos períodos de tiempo, produciendo pequeñas retracciones tisulares y siendo compatible con el inmunostaining. El glutaraldehído es un fijador más fuerte y estable que se utiliza generalmente en combinación con formaldehído. El uso de glutaraldehído tiene algunas desventajas que deben tenerse en cuenta ya que introduce algunos grupos de aldehído libre en el tejido fijo, lo que puede generar algún etiquetado inespecífico. También el reticulamiento entre proteínas y otras moléculas ocasionalmente puede hacer que algunos epítopos objetivo sean inaccesibles para los anticuerpos. Para evitar esto, la cantidad y la duración de la fijación deben definirse cuidadosamente.
Después de la fijación, las muestras se incrustan en la resina adecuada para endurecer antes de obtener las secciones. La resina acrílica london resina (LR-White) es la resina preferida para estudios de inmunolocalización. A diferencia de otras resinas, LR-White es hidrófilo, permitiendo que los anticuerpos alcancen sus antígenos, sin necesidad de ningún tratamiento para facilitarlo. LR-White también tiene la ventaja de ofrecer baja fluorescencia automática, permitiendo una reducción en el ruido de fondo durante las imágenes de inmunofluorescencia.
Hay muchas técnicas de tinción disponibles para detectar diferentes componentes de la pared celular, tales como manchas azules alcian, tinción azul toluidina o tinción periódica ácido-Schiff (PAS). Ninguno de ellos ofrece el poder de los análisis de inmunolocalización8. Este enfoque proporciona una mayor especificidad en la detección de glicanos, ofreciendo información más vasta sobre la composición y estructura de la pared celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método de inmunolocalización fluorescente en las plantas aquí descrito, aunque sin problemas sencillo, se basa en el éxito de varios pasos pequeños. El primero de los cuales es la preparación y fijación de muestras. Durante este primer paso, se utiliza una mezcla de formaldehído y glutaraldehído para reenlazar la mayoría de los componentes celulares. El formaldehído en la solución proporciona una fijación suave y reversible, mientras que el glutaraldehído proporciona una fuerte vinculación más permanen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores recibieron el apoyo del proyecto de la UE 690946 ‘SexSeed’ (Sexual Plant Reproduction – Seed Formation) financiado por H2020-MSCA-RISE-2015 y SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017. AMP recibió una subvención del proyecto MSCA-IF-2016 de la Unión Europea (núl. 753328). MC recibió una subvención de fct phD grant SFRH/BD/111781/2015.
Materials
| 25% (w/v) Gluteraldehyde | Agar Scientific | AGR1010 | aq. Solution, methanol free |
| 8 wells Glass reaction slides | Marinfeld | MARI1216750 | other brands may be used |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC antibody produce in GOAT | Sigma-Aldrich | F6258 | |
| cover slips, 24 mm x 50 mm | Marinfeld | MARI0100222 | The cover slip should cover all the wells. Other brands may be used |
| ddH2O | na | na | |
| Ethanol absolute | na | na | |
| Fluorescent brightner 28 | Sigma-Aldrich | F-6259 | |
| Gelatin capsules | Agar scientific | AGG29211 | The capsule size sould feat the size of the sample. |
| Glass vials | na | na | Any simple unexpensive glass vials that can be sealed, may be used. The vials may be clean with 96% etanol after use to remove LR-White residue and reused. |
| LR-white medium grade, embdeding resin | Agar Scientific | AGR1281 | LR-White comes in several forms the medium grade provides na adequate cutting suport for most tissues for harder tissues a harder grade of LR-white may be recomendable. If possible use a resin already mixed with the polimeration activator (benzoyl peroxide), if not please folow the instructions of the suplier to prepare the resin. |
| Non fat dry milk | Nestlé | na | any non fat dry milk is adequate |
| Oven | na | na | generic laboratory oven |
| Petri dish, 10 cm x 10 cm square | na | na | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Rat generated Monoclonal Anti-Body | Plant probes | na | Several antibodies that recognize cell wall components are available at both the Complex Carbohydrate research center (CCRC, Georgia University USA) and Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, at Leeds University UK). A short list of some commonly used MABS and where they can be purchased is presented in Supplemental Table 1 |
| Razor blades | na | na | regular razor blades |
| SDS | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| Toluidine Blue-O | Agar Scientific | AGR1727 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC7 | |
| upright epifluorescence microscope with UV and FITC fluorescence filters | Leica Mycrosistems | DMLb | |
| vaccum chamber | na | na | |
| vaccum pump | na | na | |
| Vectashield | vecta Labs | T-1000 | Other anti-fade may be used. Please do check for compatibility with FITC and the Fluorescente brightner 28. (Note: for a non-commercial alternative, (see Jonhson et al 198218) An antifade medium can be made by mixing 25 mg/mL of 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane (DABCO) in 9:1 (v/v) glycerol to 1xPBS. Adjust pH to 8.6 with diluted HCl.) |
References
- Keegstra, K. Plant Cell Walls. Plant Physiology. 154 (2), 483-486 (2010).
- Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues. Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).
- Showalter, A. Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).
- Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development. Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).
- Seifert, G., Roberts, K. The biology of arabinogalactan proteins. Annual Review of Plant Biology. 58, 137-161 (2007).
- Ruprecht, C., et al. A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies. Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).
- Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy. Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505 (2017).
- Osborn, M., Weber, K. Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures. Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).
- Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction. Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).
- Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).
- Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto. Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).
- Coimbra, S., Salema, R. Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules. Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).
- Coimbra, S., Duarte, C. Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus. Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).
- El-Tantawy, A., et al. Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus. Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).
- Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae). Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).
- Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis. Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).
- Hibbs, A. R. Fluorescence Immunolabelling. Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).
- Johnson, G. D., et al. Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy. Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).
- Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors. Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).
- Weber, G. F., Menko, A. S. Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes. BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).
