Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay für die spezifische und schnelle Detektion von Tilapia Lake Virus

Tilapia See Viruskrankheit (TiLVD) ist eine Viruserkrankung in Tilapia(Oreochromis spp.), die Berichten zufolge Tilapia Todesfälle in vielen Regionen der Welt verursacht, einschließlich Asien^1,2, Afrika, und Amerika. Die Krankheit wurde erstmals während der Massensterblichkeit von Tilapia im Jahr 2009 in Israel erkannt, wo die Zahl der wilden Tilapia im Kinneret-See dramatisch von 257 auf 8 Tonnen pro^Jahr2 sank. Die Krankheit wird durch das Tilapia-Seevirus (TiLV) verursacht, das der Familie Amnoonviridae als neue Gattung Tilapinevirus und einer neuen Art Tilapia Tilapinevirus³zugeordnet wurde. Die genetische Charakterisierung von TiLV zeigte, dass es sich bei dem Virus um ein neuartiges umhülltes, negativ-sinnliches, einsträngiges RNA-Virus handelt, das 10 Segmente hat, die 10 Proteine^1,2,4kodieren. Verschiedene Tilapia-Arten der Gattung Sarotherodon, Oreochromis, und Tilapine und andere warme Wasserfische (z.B. Riesen-Gourami (Osphronemus goramy)) haben sich als anfällig für TiLV^2,5erwiesen. Derzeit verbreitet sich dieses Virus weiterhin weltweit, möglicherweise durch die Bewegung von infizierten lebenden Fischen^6,7, während das Risiko einer viralen Übertragung über gefrorene Tilapia oder sein Produkt begrenzt ist⁸. Eine erhebliche Sterblichkeit aufgrund einer TiLV-Infektion hat das Potenzial, erhebliche negative wirtschaftliche Auswirkungen auf die Tilapia-Industrie zu haben. Zum Beispiel wurden die wirtschaftlichen Auswirkungen des Sommersterblichkeitssyndroms in Ägypten im Zusammenhang mit einer TiLV-Infektion auf 100^MillionenUS-Dollar 9 berechnet. Daher ist es wichtig, eine schnelle und angemessene Diagnosemethode zu entwickeln, um die Bekämpfung dieser Krankheit in Fischfarmen zu erleichtern.

Bisher basiert die Diagnose TiLVD auf molekularen Assays, viraler Isolation und Histopathologie. Für die TiLV-Diagnose^10,11wurden verschiedene PCR-Protokolle und Primer entwickelt. Zum Beispiel wurde eine SYBR-Grün-basierte Reverse-Transkriptions-quantitative PCR-Methode (RT-qPCR) mit der Empfindlichkeit entwickelt und validiert, nur zwei Kopien/L des Virus zu^erkennen. Andere PCR-Methoden für die TiLV-Erkennung sind TaqMan quantitative PCR¹¹, RT-PCR², geschachtelte RT-PCR¹²und semi-nested RT-PCR¹³. Diese Methoden erfordern jedoch ausgeklügelte Laborausrüstung und relativ lange Zeiträume, um aufgrund der Komplexität der Reaktionen Ergebnisse zu erzielen, was sie für die Feldanwendung ungeeignet macht.

Der schleifenvermittelte isotherme Amplifikationstest (LAMP) ist ein schneller, einfacher und praktischer For-Field-Anwendung^14,15. Die Technik verwendet das Prinzip einer Strangverschiebungsreaktion, während die Amplifikationsreaktion unter isothermen Bedingungen ohne einen ausgeklügelten und teuren Thermischen Cycler^14,15läuft. Daher werden verstärkte LAMP-Produkte oder RT-LAMP-Produkte in leiterartigen Bändern mit Agarose-Gel-Elektrophorese mit einem fluoreszierenden Fleck entweder zur sicheren Visualisierung von DNA oder RNA¹⁴ oder zur Beobachtung mit bloßem Auge auf das Vorhandensein von Trübung oder einem weißen Niederschlag^16,17,18analysiert. Aus diesen Gründen wurde diese Technik für den Nachweis verschiedener Fischpathogene vor Ort^{17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27}. Der Zweck dieser Studie war es, einen schnellen, empfindlichen und genauen RT-LAMP-Test für die TiLV-Erkennung zu etablieren. Der RT-LAMP-Test bietet ein Screening auf TiLV in Fischproben innerhalb von 30 min. Die Technik kann für die Diagnose und Überwachung von TiLVD angewendet werden.