Обратная транскрипция петли-опосредованное Изотермальная усиление (RT-LAMP) Ассадля для специфического и быстрого обнаружения вируса озера Тилапия

Болезнь озера Tilapia (TiLVD) является вирусным заболеванием в тилапии(Oreochromis spp.), которая, как сообщается, вызывает смерть от тилапии во многих регионах мира, включая Азию^1,2, Африку и Америку. Болезнь была впервые признана во время массовой смертности тилапии в 2009 году в Израиле, где количество диких тилапий в озере Киннерет резко упало с 257 до 8 тонн в год². Болезнь вызвана вирусом озера Тилапия (TiLV), который был назначен семье Amnoonviridae как новый род Tilapinevirus и новый вид Tilapia tilapinevirus³. Генетическая характеристика TiLV показала, что вирус является новым окутанным, отрицательным смыслом, одноцепочечным РНК-вирусом, который имеет 10 сегментов, кодирующих 10 белков^1,,2,,4. Различные виды тилапии в роду Sarotherodon, Oreochromis, и Тилапин и другие теплые рыбы воды (например, гигантские гурами (Osphronemus goramy)) было показано, чтобы быть восприимчивыми к TiLV^2,5. В настоящее время этот вирус продолжает распространяться по всему миру, возможно, через движение инфицированных живой рыбы^6,7, в то время как риск вирусной передачи через замороженные тилапии или его продукт ограничен⁸. Существенная смертность от инфекции TiLV может оказать значительно пагубное экономическое воздействие на индустрию тилапии. Например, экономический эффект от летнего синдрома смертности в Египте, связанный с инфекцией TiLV, был рассчитан на US$100 млн^9. Соответственно, важно разработать быстрый и надлежащий метод диагностики для облегчения борьбы с этим заболеванием в рыбоводных хозяйствах.

До сих пор диагноз TiLVD был основан на молекулярных анализах, вирусной изоляции и гистопатологии. Для диагностики TiLV^10,,11были разработаны различные протоколы ПЦР и грунтовки. Например, sYBR зеленый основе обратной транскрипции количественного ПЦР (RT-qPCR) метод с чувствительностью для обнаружения всего лишь две копии / КЛ вируса была разработана и проверена для обнаружения TiLV¹⁰. Другие методы ПЦР для обнаружения TiLV включают TaqMan количественные PCR¹¹, RT-PCR², вложенный RT-PCR¹², и полу-гнездо RT-PCR¹³. Однако эти методы требуют сложного лабораторного оборудования и относительно длительных периодов времени для получения результатов из-за сложности реакций, что делает их непригодными для применения на местах.

Цикл опосредованное изотермального усиления (LAMP) анализ является быстрым, простым и практичным для поля применения^14,15. Техника использует принцип реакции смещения нити, в то время как реакция усиления проходит в изотермических условиях без сложного и дорогого теплового циклизатора^14,15. Следовательно, усиленные продукты LAMP или продукты RT-LAMP анализируются в трапа-подобных полосах с использованием электрофореза геля агарозы с флуоресцентным пятном либо для безопасной визуализации ДНК или РНК^14, либо наблюдения невооруженным глазом за наличие мутной или белой осадки^16,17,18. По этим причинам данная методика была использована для обнаружения на месте различных рыбных патогенов^{17,,18,,19,,20,,21,,22,,23,,24,,25,,26,,27}. Целью данного исследования было создание быстрого, чувствительного и точного исследования RT-LAMP для обнаружения TiLV. Анализ RT-LAMP предлагает скрининг на TiLV в образцах рыбы в течение 30 минут. Методика может быть применена для диагностики и наблюдения TiLVD.