הפוך תמלול לולאה בתיווך איזותרמי הגברה (RT-מנורה) שיטת הזיהוי הספציפי והמהיר של וירוס אמנון לייק
Summary
אנו מציגים שיטת RT-מנורה לגילוי של TiLV בדגים אמנון באמצעות כלים פשוטים על פני תקופה קצרה יחסית של זמן לעומת טכניקות RT-PCR קונבנציונאלי. פרוטוקול זה עשוי לעזור לשלוט על התפשטות המגיפה של TiLVD, במיוחד במדינות מתפתחות.
Abstract
אמנון וירוס מחלת האגם (TiLVD), מחלה נגיפית המתעוררים ב אמנון הנגרמת על ידי וירוס האגם אמנון (Tilvd), הוא אתגר מתמשך בתעשיית מידגה כי הביא את התחלואה ההמוני ואת התמותה של אמנון בחלקים רבים של העולם. יעילה, מהירה, ומדויקת אבחון מדויק עבור זיהום TiLV הוא אפוא הכרחי כדי לזהות את הזיהום הראשוני כדי למנוע את התפשטות המחלה בחקלאות מידגה. במחקר זה, לולאה הפוכה רגיש מאוד ומעשי לולאת איזותרמי הגברה (RT-מנורה) שיטה מוצגת לזיהוי וירוס האגם אמנון ברקמת הדג. השוואה של rt-qpcr ו-rt-המנורה בחני של דגימות נגוע חשף תוצאות חיוביות ב 63 (100%) ו 51 (80.95%) דגימות, בהתאמה. יתר על כן, ניתוח של דגימות נגוע הראו כי כל 63 רקמות נגוע הניבו תוצאות שליליות הן RT-qPCR ו-RT-המנורה assays. החוצה הפעילות הצולבת עם חמישה פתוגנים ב אמנון הוערך באמצעות RT-מנורה, וכל הבדיקות הראו תוצאות שליליות. הן הכבד והן דגימות ריר שהתקבלו מדגים נגועים הראו תוצאות דומות באמצעות RT-המנורה שיטה, רומז כי ריר ניתן להשתמש RT-מנורה כמו שיטת לא קטלני כדי למנוע הריגת דגים. לסיכום, התוצאות הראו כי הציג RT-מנורה שיטת מספק שיטה יעילה לזיהוי TiLV ברקמת אמנון בתוך 1 h. לפיכך, השיטה מומלצת ככלי הקרנה בחוות לאבחון מהיר של TiLV.
Introduction
אמנון וירוס מחלת האגם (tilvd) היא מחלה נגיפית ב אמנון (oreochromis spp.) כי הדיווחים גורם מקרי מוות אמנון באזורים רבים של העולם, כולל אסיה1,2, אפריקה, ואמריקה. המחלה הוכרה לראשונה בתקופת התמותה ההמונית של האמנון ב-2009 בישראל, כאשר מספר האמנון הפראי באגם כנרת צנח באופן דרמטי מ-257 ל -8 טון בשנה2. המחלה נגרמת על ידי וירוס באגם האמנון (TiLV), אשר הוקצה המשפחה האמריתיים כסוג חדש tilapinevirus ו אמנון מיני חדש tilapinevirus3. האפיון הגנטי של tilv הראה כי הווירוס הוא הרומן עטוף, שלילי-הגיון, יחיד תקוע וירוס RNA כי יש 10 מקטעים קידוד 10 חלבונים1,2,4. מינים שונים של אמנון בסוג סרטרדון, oreochromis, ו tilapine ודגי מים חמים אחרים (למשל, גורמי ענק (osphronemus גוראמי) הוכחו להיות רגישים כדי tilv2,5. כיום, וירוס זה ממשיך להתפשט ברחבי העולם, אולי דרך התנועה של הנגועים דגים חיים6,7, בעוד הסיכון של שידור נגיפי דרך אמנון קפוא או המוצר שלה הוא מוגבל8. תמותה ניכרת בשל זיהום TiLV יש את הפוטנציאל יש השפעה כלכלית מזיקה משמעותית על תעשיית האמנון. לדוגמה, ההשפעה הכלכלית של תסמונת תמותת הקיץ במצרים המשויכת לזיהום TiLV חושבה להיות $100 מיליון9. לכן, חשוב לפתח שיטת אבחון מהירה ונאותה כדי להקל על השליטה במחלה זו בחוות הדגים.
עד עכשיו, האבחנה של TiLVD התבססה על מולקולרית הספר, בידוד נגיפי, ו histopathology. פרוטוקולים מסוגים שונים של PCR והתחל פותחו עבור אבחון TiLV10,11. למשל, שיטת SYBR ירוק מבוססי הפוכה PCR כמותי (RT-qPCR) שיטה עם רגישות לזהות כמה כמו שני עותקים/μL של הווירוס פותחה ואומת עבור הזיהוי TiLV10. שיטות ה-PCR האחרות לזיהוי TiLV כוללות את ה-PCR הכמותי של TaqMan11, RT-pcr2, מקונן rt-pcr12, ומקונן למחצה, rt-pcr13. עם זאת, שיטות אלה דורשות ציוד מעבדה מתוחכם ופרקי זמן מורחבים יחסית כדי להניב תוצאות בשל מורכבות התגובות, מה שהופך אותם לאינם מתאימים ליישום שדה.
האיזותרמי לולאה בתיווך הגברה (מנורה) הוא יישום מהיר, פשוט ופרקטי לשדה14,15. הטכניקה מעסיקה את העיקרון של תגובת העתקה סטרנד, בעוד תגובת הגברה פועלת בתנאים איזותרמי ללא מתוחכם ויקר הציקלאה תרמית14,15. כתוצאה מכך, מוצרים מנורה מוגברת או RT-מנורה מוצרים מנותח בלהקות כמו הסולם באמצעות אגקום ג ‘ ל ג’ל עם כתם פלורסנט עבור או הדמיה בטוחה של DNA או RNA14 או התבוננות עם עין בעירום לנוכחות של עכירות או לבנים מעלה16,17,18. מסיבות אלה, טכניקה זו שימש לזיהוי באתר של פתוגנים דגים שונים17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. מטרת מחקר זה היה להקים מהירה, רגיש, מדויק RT-מנורה שיטת זיהוי TiLV. The RT-מנורה מציעה הקרנה של TiLV בדגימות דגים בתוך 30 דקות. ניתן ליישם את הטכניקה לאבחון ומעקב של TiLVD.
Protocol
Representative Results
Discussion
תעשיית מידגה מאוימת ברציפות על ידי זיהומים נגיפי הגורמים הפסדים כלכליים ניכרים9,23,28. למשל, tilv המתעוררים מהווה איום גדול למדינות מניבות אמנון בחלקים רבים של העולם1,6,9. עד עכשיו, לא היו therapeut…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפרויקט ממומן כלכלית על ידי קרן תאילנד מחקר (trf) מענק מספר RDG6050078 והמרכז ללימודים מתקדמים לחקלאות ומזון, המכון ללימודים מתקדמים, אוניברסיטת kasetsart, בנגקוק, תאילנד תחת קידום מחקר ההשכלה הגבוהה ופרויקט המחקר הלאומי של תאילנד, משרד ועדת ההשכלה הגבוהה, משרד ה המחקר נתמך בחלקו על ידי מלגת הלימודים לתואר שני מבית הספר לתארים מוסמכים, אוניברסיטת קאסטסארט. המחברים רוצים להודות לד ר Kwanrawee Sirikanchana לגבי הנרטיב העלילתי של וידאו ופייוואווצ סיקרין לעריכת הווידאו.
Materials
| Tissue collection: | |||
| Clove oil | Better Pharma | N/A | |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative option to clove oil |
| RNA extraction: | |||
| Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) | ThermoFisher Scientific Corp. | 15596026 | |
| Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) | Geneaid | GZR100 | |
| Direct-zol RNA Kit: | Zymo Research | R2071 | |
| – Direct-zol RNA PreWash | |||
| – RNA Wash Buffer | |||
| – DNase/RNase-free water | |||
| – Zymo-spin IIICG columns | |||
| – Collection Tubes | |||
| RT-LAMP: | |||
| 1x SD II reaction buffer | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| dNTP set | Bioline | BIO-39053 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B2629 | |
| Calcein mixture | Merck | 1461-15-0 | |
| Bst DNA polymerase | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| AMV reverse transcriptase | Promega | M510A | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10320995 | |
| Elite dry bath incubator, single unit | Major Science | EL-01-220 | |
| Gel electrophoresis: | |||
| Agarose | Vivantis Technologies | PC0701-500G | |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | Sigma-Aldrich | SRE0062 | |
| Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer: | |||
| – Tris | Vivantis Technologies | PR0612-1KG | |
| – Acetic acid (glacial), EMSURE | Merck Millipore | 1000632500 | |
| – Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec | Sigma-Aldrich | V800170-500G | |
| Neogreen | NeoScience Co., Ltd. | GR107 | |
| DNA gel loading dye (6X) | ThermoFisher Scientific Corp. | R0611 | |
| DNA ladder and markers | Vivantis Technologies | PC701-100G | |
| Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) | Bio-Rad | 1704487 | |
| PowerPac HC power supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Gel Doc EZ System | Bio-Rad | 1708270 | |
| UV sample tray | Bio-Rad | 1708271 | |
| NαBI imager | Neogene Science | ||
| cDNA synthesis: | |||
| ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | |
| Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis Technologies | cDSK01 | An alternative option for cDNA synthesis |
| NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) | ThermoFisher Scientific Corp. | ND-2000 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| RT-qPCR: | |||
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725120 | |
| Nuclease-free water, sterile water | MultiCell | 809-115-CL | |
| 8-tube PCR strips, white | Bio-Rad | TLS0851 | |
| Flat PCR tube 8-cap strips, optical | Bio-Rad | TCS0803 | |
| CFX96 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1855196 | |
| General equipment and materials: | |||
| Mayo scissors | N/A | ||
| Forceps | N/A | ||
| Vortex Genie 2 (vortex mixer) | Scientific Industries | ||
| Microcentrifuge LM-60 | LioFuge | CM610 | |
| Corning LSE mini microcentrifuge | Corning | 6765 | |
| Pipettes | Rainin | Pipete-Lite XLS | |
| QSP filtered pipette tips | Quality Scientific Plastics | TF series | |
| Corning Isotip filtered tips | Merck | CLS series | |
| Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST | Wuxi NEST Biotechnology | 615601 |
References
- Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
- Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
- Adams, M. J., et al. Changes to taxonomy and the International Code of Virus Classification and Nomenclature ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses (2017). Archives of Virology. 162 (8), 2505-2538 (2017).
- Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), 00431 (2016).
- Jaemwimol, P., et al. Susceptibility of important warm water fish species to tilapia lake virus (TiLV) infection. Aquaculture. 497, 462-468 (2018).
- Giews, F. Global Information and Early Warning System On Food And Agriculture. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , (2017).
- Al-Hussinee, L., Subramaniam, K., Ahasan, M. S., Keleher, B., Waltzek, T. B. Complete Genome Sequence of a Tilapia Lake Virus Isolate Obtained from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Genome Announcements. 6 (26), (2018).
- Thammatorn, W., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Minimal risk of tilapia lake virus transmission via frozen tilapia fillets. Journal of Fish Diseases. 42 (1), 3-9 (2019).
- Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by ‘summer mortality’ syndrome. Aquaculture. 473, 430-432 (2017).
- Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
- Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture. 497, 184-188 (2018).
- Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
- Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture. 476, 111-118 (2017).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), 63 (2000).
- Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. Journal of Infection and Chemotherapy. 15 (2), 62-69 (2009).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 289 (1), 150-154 (2001).
- Caipang, C. M., Haraguchi, I., Ohira, T., Hirono, I., Aoki, T. Rapid detection of a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Journal of Virological Methods. 121 (2), 155-161 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification. Virology Journal. 2, 83 (2005).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Venugopal, M. N., Sakai, M. Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Fish Diseases. 27 (10), 583-589 (2004).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Lapatra, S. E., Sakai, M. A loop mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Archives of Virology. 150 (5), 899-909 (2005).
- Kono, T., Savan, R., Sakai, M., Itami, T. Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 115 (1), 59-65 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS). Veterinary Microbiology. 114 (3-4), 205-213 (2006).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri. Journal of Microbiological Methods. 63 (1), 36-44 (2005).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Sensitive and rapid detection of Flavobacterium columnare in channel catfish Ictalurus punctatus by a loop-mediated isothermal amplification method. Journal of Applied Microbiology. 100 (5), 919-925 (2006).
- Sun, Z. F., Hu, C. Q., Ren, C. H., Shen, Q. Sensitive and rapid detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in shrimps by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 131 (1), 41-46 (2006).
- Shivappa, R. B., et al. Detection of spring viraemia of carp virus (SVCV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in koi carp, Cyprinus carpio L. Journal of Fish Diseases. 31 (4), 249-258 (2004).
- Wei, X. N., Zheng, Z. J., Zhang, L. H., Qu, F., Huang, X. Sensitive and rapid detection of Aeromonas caviae in stool samples by loop-mediated isothermal amplification. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 60 (1), 113-116 (2008).
- Chinabut, S., Puttinaowarat, S. The choice of disease control strategies to secure international market access for aquaculture products. Developmental Biology. 121, 255-261 (2005).
- Soto, E., Yun, S., Surachetpong, W. Susceptibility of Tilapia Lake Virus to buffered Povidone-iodine complex and chlorine. Aquaculture. 512, 734342 (2019).
- Jaemwimol, P., Sirikanchana, K., Tattiyapong, P., Mongkolsuk, S., Surachetpong, W. Virucidal effects of common disinfectants against tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (10), 1383-1389 (2019).
- Jansen, M. D., Dong, H. T., Mohan, C. V. Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia industry. Reviews in Aquaculture. 11 (3), 725-739 (2019).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Savan, R., Kono, T., Itami, T., Sakai, M. Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens. Journal of Fish Diseases. 28 (10), 573-581 (2005).
- Phusantisampan, T., Tattiyapong, P., Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Rapid detection of tilapia lake virus using a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Aquaculture. 507, 35-39 (2019).
- Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture. 486, 75-80 (2018).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Khan, R. S. A., et al. Rapid detection of infectious bursal disease by loop-mediated isothermal amplification for field analysis. Iranian Journal of Veterinary Research. 19 (2), 101-107 (2018).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
- Debode, F., Marien, A., Janssen, E., Bragard, C., Berben, G. The influence of amplicon length on real-time PCR results. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 21 (1), 3-11 (2017).
