عكس النسخ حلقة بوساطة Isothermal التضخيم (RT-LAMP) القول للكشف المحدد والسريع لفيروس بحيرة البلطي
Summary
نحن نقدم قياس RT-LAMP للكشف عن TiLV في أسماك البلطي باستخدام أدوات بسيطة على مدى فترة قصيرة نسبيًا من الزمن مقارنة بتقنيات RT-PCR التقليدية. وقد يساعد هذا البروتوكول في مكافحة انتشار وباء الـ TiLVD، ولا سيما في البلدان النامية.
Abstract
يمثل مرض فيروس بحيرة البلطي (TiLVD)، وهو مرض فيروسي ناشئ في البلطي بسبب فيروس بحيرة البلطي (TiLV)، تحدياً مستمراً في صناعة تربية الأحياء المائية أدى إلى الاعتلال والوفيات الجماعية للبلطي في أجزاء كثيرة من العالم. ولذلك فإن الفحص التشخيصي الفعال والسريع والدقيق لعدوى التيلفي ضروري للكشف عن العدوى الأولية ومنع انتشار المرض في تربية الأحياء المائية. في هذه الدراسة، يتم تقديم طريقة التضخيم اللابدي (RT-LAMP) الحساسة للغاية والعملية للنسخ العكسي (RT-LAMP) للكشف عن فيروس بحيرة البلطي في أنسجة الأسماك. وكشفت مقارنة بين العينات المصابة بـ RT-qPCR وRT-LAMP عن نتائج إيجابية في 63 (100%) و51 (80.95%) عينات، على التوالي. وعلاوة على ذلك، أظهر تحليل للعينات غير المصابة أن جميع الأنسجة غير المصابة البالغ عددها 63 أنسجة أسفرت عن نتائج سلبية لكل من المقالات RT-qPCR و RT-LAMP. تم تقييم التفاعل المتبادل مع خمسة مسببات الأمراض في البلطي باستخدام RT-LAMP ، وأظهرت جميع الاختبارات نتائج سلبية. وأظهرت كل من عينات الكبد والمخاط التي تم الحصول عليها من الأسماك المصابة نتائج مماثلة باستخدام طريقة RT-LAMP، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام المخاط في RT-LAMP كفحص غير قاتل لتجنب قتل الأسماك. وفي الختام، أظهرت النتائج أن فحص RT-LAMP المقدم يوفر طريقة فعالة للكشف عن TiLV في أنسجة البلطي في غضون ساعة واحدة. ولذلك يوصى بهذه الطريقة كأداة فحص في المزارع للتشخيص السريع لـ TiLV.
Introduction
مرض فيروس بحيرة البلطي (TiLVD) هو مرض فيروسي في البلطي(Oreochromis spp.) الذي يتسبب في وفيات البلطي في العديد من مناطق العالم، بما في ذلك آسيا1،,2،أفريقيا، وأمريكا. وقد تم التعرف على المرض لأول مرة خلال الوفيات الجماعية للبلطي في عام 2009 في إسرائيل، حيث انخفض عدد البلطي البري في بحيرة كنريت بشكل كبير من 257 إلى 8 أطنان في السنة2. ويتسبب هذا المرض من فيروس بحيرة البلطي (TiLV), التي تم تعيينها للأسرة Amnoonviridae كجنس جديد فيروس البلطي والأنواع الجديدة البلطي فيروس3. التوصيف الجيني لTiLV أظهرت أن الفيروس هو رواية مغلفة، المعنى السلبي، فيروس الحمض النووي الريبي واحد الذين تقطعت بهم السبل التي لديها 10 شرائح ترميز 10 البروتينات1،,2،,4. وقد ثبت أنواع مختلفة من البلطي في جنس Sarotherodon، Oreochromis، وTilapine وغيرها من أسماك المياه الدافئة (على سبيل المثال ، gourami العملاقة(Osphronemus goramy))لتكون عرضة لTiLV2،5. حاليا، يستمر هذا الفيروس في الانتشار عالميا، ربما من خلال حركة الأسماك الحية المصابة6،7، في حين أن خطر انتقال الفيروس عبر البلطي المجمد أو منتجه محدود8. وقد يكون للوفيات الكبيرة الناجمة عن عدوى التيلفيل أثر اقتصادي ضار إلى حد كبير على صناعة البلطي. على سبيل المثال، تم حساب الأثر الاقتصادي لمتلازمة الوفيات الصيفية في مصر المرتبطة بعدوى TiLV بمبلغ 100 مليون دولار أمريكي9. وبناء على ذلك، من المهم تطوير طريقة تشخيصية سريعة ومناسبة لتسهيل مكافحة هذا المرض في المزارع السمكية.
حتى الآن ، كان تشخيص TiLVD يستند إلى المقالات الجزيئية ، والعزلة الفيروسية ، وعلم الأمراض الهستي. وقد وضعت بروتوكولات PCR مختلفة والتمهيديات لتشخيص TiLV10,11. على سبيل المثال، تم تطوير والتحقق من صحة طريقة SYBR المستندة إلى النسخ العكسي الكمي PCR (RT-qPCR) مع حساسية للكشف عن نسختين/ميكرولتر من الفيروس والتحقق من صحتها للكشف عن TiLV10. وتشمل أساليب PCR الأخرى للكشف عن TiLV TaqMan الكمية PCR11،RT-PCR2،RT-PCR12متداخلة، وشبه متداخلة RT-PCR13. غير أن هذه الأساليب تتطلب معدات مختبرية متطورة وفترات زمنية ممتدة نسبياً لتحقيق نتائج بسبب تعقيد ردود الفعل، مما يجعلها غير مناسبة للتطبيق الميداني.
التضخيم isothermal حلقة بوساطة (مصباح) والقول هو سريع وبسيط وعملي لتطبيق الميدان14،15. هذه التقنية توظف مبدأ رد فعل الإزاحة حبلا، في حين أن رد فعل التضخيم يعمل تحت ظروف isothermal دون cycler الحرارية متطورة ومكلفة14،,15. وبالتالي، يتم تحليل منتجات مصباح تضخيم أو منتجات RT-LAMP في عصابات تشبه السلم باستخدام الجيل الكهربائي agarose مع بقعة الفلورسنت إما للتصور الآمن للحمض النووي أو الحمض النووي الريبي14 أو المراقبة بالعين المجردة لوجود التعكر أو عجلت بيضاء16،17،18. لهذه الأسباب، وقد استخدمت هذه التقنية للكشف في الموقع من مسببات الأمراض الأسماك المختلفة17،,18،,19،,20،,21،,22،23،,24،,25،,26،,27., كان الغرض من هذه الدراسة هو إنشاء تصريح سريع وحساس ودقيق لـ RT-LAMP للكشف عن TiLV. يوفر فحص RT-LAMP فحص ًا لـ TiLV في عينات الأسماك في غضون 30 دقيقة. ويمكن تطبيق هذه التقنية لتشخيص ومراقبة TiLVD.
Protocol
Representative Results
Discussion
تتعرض صناعة الاستزراع المائي باستمرار للتهديد من قبل العدوى الفيروسية التي تسبب خسائر اقتصادية كبيرة9,23,28. على سبيل المثال ، يمثل TiLV الناشئ تهديدًا كبيرًا للبلدان المنتجة للبلطي في أجزاء كثيرة من العالم1،6…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم تمويل المشروع ماليا من قبل صندوق البحوث التايلاندية (TRF) رقم منحة RDG6050078 ومركز الدراسات المتقدمة للزراعة والأغذية، معهد الدراسات المتقدمة، جامعة كاسيسارت، بانكوك، تايلاند في إطار مشروع تعزيز بحوث التعليم العالي وجامعة البحوث الوطنية في تايلاند، مكتب لجنة التعليم العالي، وزارة التعليم، تايلاند. يتم دعم البحث جزئيًا من خلال منحة برنامج الدراسات العليا من كلية الدراسات العليا، جامعة كاسيسارت. ويود المؤلفان أن يشكرا الدكتور كوانراوي سيريكانشانا على السرد الذي تحدث عن الفيديو وبياوسارا سيكارين لتحرير الفيديو.
Materials
| Tissue collection: | |||
| Clove oil | Better Pharma | N/A | |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative option to clove oil |
| RNA extraction: | |||
| Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) | ThermoFisher Scientific Corp. | 15596026 | |
| Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) | Geneaid | GZR100 | |
| Direct-zol RNA Kit: | Zymo Research | R2071 | |
| – Direct-zol RNA PreWash | |||
| – RNA Wash Buffer | |||
| – DNase/RNase-free water | |||
| – Zymo-spin IIICG columns | |||
| – Collection Tubes | |||
| RT-LAMP: | |||
| 1x SD II reaction buffer | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| dNTP set | Bioline | BIO-39053 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B2629 | |
| Calcein mixture | Merck | 1461-15-0 | |
| Bst DNA polymerase | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| AMV reverse transcriptase | Promega | M510A | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10320995 | |
| Elite dry bath incubator, single unit | Major Science | EL-01-220 | |
| Gel electrophoresis: | |||
| Agarose | Vivantis Technologies | PC0701-500G | |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | Sigma-Aldrich | SRE0062 | |
| Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer: | |||
| – Tris | Vivantis Technologies | PR0612-1KG | |
| – Acetic acid (glacial), EMSURE | Merck Millipore | 1000632500 | |
| – Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec | Sigma-Aldrich | V800170-500G | |
| Neogreen | NeoScience Co., Ltd. | GR107 | |
| DNA gel loading dye (6X) | ThermoFisher Scientific Corp. | R0611 | |
| DNA ladder and markers | Vivantis Technologies | PC701-100G | |
| Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) | Bio-Rad | 1704487 | |
| PowerPac HC power supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Gel Doc EZ System | Bio-Rad | 1708270 | |
| UV sample tray | Bio-Rad | 1708271 | |
| NαBI imager | Neogene Science | ||
| cDNA synthesis: | |||
| ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | |
| Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis Technologies | cDSK01 | An alternative option for cDNA synthesis |
| NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) | ThermoFisher Scientific Corp. | ND-2000 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| RT-qPCR: | |||
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725120 | |
| Nuclease-free water, sterile water | MultiCell | 809-115-CL | |
| 8-tube PCR strips, white | Bio-Rad | TLS0851 | |
| Flat PCR tube 8-cap strips, optical | Bio-Rad | TCS0803 | |
| CFX96 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1855196 | |
| General equipment and materials: | |||
| Mayo scissors | N/A | ||
| Forceps | N/A | ||
| Vortex Genie 2 (vortex mixer) | Scientific Industries | ||
| Microcentrifuge LM-60 | LioFuge | CM610 | |
| Corning LSE mini microcentrifuge | Corning | 6765 | |
| Pipettes | Rainin | Pipete-Lite XLS | |
| QSP filtered pipette tips | Quality Scientific Plastics | TF series | |
| Corning Isotip filtered tips | Merck | CLS series | |
| Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST | Wuxi NEST Biotechnology | 615601 |
References
- Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
- Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
- Adams, M. J., et al. Changes to taxonomy and the International Code of Virus Classification and Nomenclature ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses (2017). Archives of Virology. 162 (8), 2505-2538 (2017).
- Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), 00431 (2016).
- Jaemwimol, P., et al. Susceptibility of important warm water fish species to tilapia lake virus (TiLV) infection. Aquaculture. 497, 462-468 (2018).
- Giews, F. Global Information and Early Warning System On Food And Agriculture. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , (2017).
- Al-Hussinee, L., Subramaniam, K., Ahasan, M. S., Keleher, B., Waltzek, T. B. Complete Genome Sequence of a Tilapia Lake Virus Isolate Obtained from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Genome Announcements. 6 (26), (2018).
- Thammatorn, W., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Minimal risk of tilapia lake virus transmission via frozen tilapia fillets. Journal of Fish Diseases. 42 (1), 3-9 (2019).
- Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by ‘summer mortality’ syndrome. Aquaculture. 473, 430-432 (2017).
- Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
- Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture. 497, 184-188 (2018).
- Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
- Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture. 476, 111-118 (2017).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), 63 (2000).
- Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. Journal of Infection and Chemotherapy. 15 (2), 62-69 (2009).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 289 (1), 150-154 (2001).
- Caipang, C. M., Haraguchi, I., Ohira, T., Hirono, I., Aoki, T. Rapid detection of a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Journal of Virological Methods. 121 (2), 155-161 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification. Virology Journal. 2, 83 (2005).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Venugopal, M. N., Sakai, M. Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Fish Diseases. 27 (10), 583-589 (2004).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Lapatra, S. E., Sakai, M. A loop mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Archives of Virology. 150 (5), 899-909 (2005).
- Kono, T., Savan, R., Sakai, M., Itami, T. Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 115 (1), 59-65 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS). Veterinary Microbiology. 114 (3-4), 205-213 (2006).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri. Journal of Microbiological Methods. 63 (1), 36-44 (2005).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Sensitive and rapid detection of Flavobacterium columnare in channel catfish Ictalurus punctatus by a loop-mediated isothermal amplification method. Journal of Applied Microbiology. 100 (5), 919-925 (2006).
- Sun, Z. F., Hu, C. Q., Ren, C. H., Shen, Q. Sensitive and rapid detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in shrimps by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 131 (1), 41-46 (2006).
- Shivappa, R. B., et al. Detection of spring viraemia of carp virus (SVCV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in koi carp, Cyprinus carpio L. Journal of Fish Diseases. 31 (4), 249-258 (2004).
- Wei, X. N., Zheng, Z. J., Zhang, L. H., Qu, F., Huang, X. Sensitive and rapid detection of Aeromonas caviae in stool samples by loop-mediated isothermal amplification. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 60 (1), 113-116 (2008).
- Chinabut, S., Puttinaowarat, S. The choice of disease control strategies to secure international market access for aquaculture products. Developmental Biology. 121, 255-261 (2005).
- Soto, E., Yun, S., Surachetpong, W. Susceptibility of Tilapia Lake Virus to buffered Povidone-iodine complex and chlorine. Aquaculture. 512, 734342 (2019).
- Jaemwimol, P., Sirikanchana, K., Tattiyapong, P., Mongkolsuk, S., Surachetpong, W. Virucidal effects of common disinfectants against tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (10), 1383-1389 (2019).
- Jansen, M. D., Dong, H. T., Mohan, C. V. Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia industry. Reviews in Aquaculture. 11 (3), 725-739 (2019).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Savan, R., Kono, T., Itami, T., Sakai, M. Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens. Journal of Fish Diseases. 28 (10), 573-581 (2005).
- Phusantisampan, T., Tattiyapong, P., Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Rapid detection of tilapia lake virus using a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Aquaculture. 507, 35-39 (2019).
- Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture. 486, 75-80 (2018).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Khan, R. S. A., et al. Rapid detection of infectious bursal disease by loop-mediated isothermal amplification for field analysis. Iranian Journal of Veterinary Research. 19 (2), 101-107 (2018).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
- Debode, F., Marien, A., Janssen, E., Bragard, C., Berben, G. The influence of amplicon length on real-time PCR results. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 21 (1), 3-11 (2017).
