Approccio stereotassico angolato adattabile per tecniche di neuroscienze versatili
Summary
Qui è descritta una procedura stereotassica che può colpire regioni cerebrali impegnative e difficili da raggiungere (a causa di limitazioni spaziali) utilizzando un approccio coronale angolato. Questo protocollo è adattabile sia a modelli murini che di ratto e può essere applicato a diverse applicazioni neuroscientifiche, tra cui l’impianto di cannule e microiniezioni di costrutti virali.
Abstract
La chirurgia stereotassica è uno strumento essenziale nel moderno laboratorio di neuroscienze. Tuttavia, la capacità di indirizzare in modo preciso e preciso le regioni cerebrali difficili da raggiungere rappresenta ancora una sfida, in particolare quando si prendono di mira le strutture cerebrali lungo la linea mediana. Queste sfide includono l’evitamento del seno sagittale superiore e del terzo ventricolo e la capacità di colpire costantemente nuclei cerebrali selettivi e discreti. Inoltre, le tecniche di neuroscienza più avanzate (ad esempio, optogenetica, fotometria delle fibre e imaging a due fotoni) si basano sull’impianto mirato di hardware significativo al cervello e le limitazioni spaziali sono un ostacolo comune. Qui viene presentato un protocollo modificabile per il targeting stereotassico delle strutture cerebrali dei roditori utilizzando un approccio coronale angolato. Può essere adattato a 1) modelli di topi o ratti, 2) varie tecniche di neuroscienza e 3) più regioni del cervello. Come esempio rappresentativo, include il calcolo delle coordinate stereotassica per il targeting del nucleo ventromediale ipotalamico di topo (VMN) per un esperimento di inibizione optogenetica. Questa procedura inizia con la microiniezione bilaterale di un virus adeno-associato (AAV) che codifica un canale del cloruro sensibile alla luce (SwiChR ++) in un modello murino Cre-dipendente, seguito dall’impianto bilaterale angolato di cannule in fibra ottica. Utilizzando questo approccio, i risultati mostrano che l’attivazione di un sottoinsieme di neuroni VMN è necessaria per le risposte controregolatorie del glucosio intatte all’ipoglicemia indotta dall’insulina.
Introduction
Il controllo neurale del comportamento, dell’alimentazione e del metabolismo comporta il coordinamento di neurocircuiti altamente complessi, integrativi e ridondanti. Un obiettivo trainante del campo delle neuroscienze è quello di sezionare la relazione tra struttura e funzione del circuito neuronale. Sebbene gli strumenti classici delle neuroscienze (ad esempio, lesioni, iniezioni farmacologiche locali e stimolazione elettrica) abbiano scoperto conoscenze vitali riguardanti il ruolo di specifiche regioni del cervello che controllano il comportamento e il metabolismo, questi strumenti sono limitati dalla loro mancanza di specificità e reversibilità1.
I recenti progressi nel campo delle neuroscienze hanno notevolmente migliorato la capacità di interrogare e manipolare la funzione del circuito in un modo specifico di tipo cellulare con un’alta risoluzione spaziotemporale. Gli approcci optogenetici2 e chemiogenetici3, ad esempio, consentono la manipolazione rapida e reversibile dell’attività in tipi di cellule geneticamente definiti di animali che si muovono liberamente. L’optogenetica prevede l’uso di canali ionici sensibili alla luce, chiamati channelrhodopsins, per controllare l’attività neuronale. La chiave di questa tecnica è la consegna genica di channelrhodopsin e una fonte di luce per attivare l’opsina. Una strategia comune per la consegna dei geni è attraverso una combinazione di 1) topi geneticamente modificati che esprimono Cre-ricombiinasi in neuroni discreti e 2) vettori virali cre-dipendenti che codificano per la channelrhodopsin.
Mentre l’optogenetica fornisce un mezzo elegante e altamente preciso per controllare l’attività neuronale, il metodo è subordinato al successo della microiniezione stereotassica del vettore virale e del posizionamento delle fibre ottiche in una regione cerebrale definita. Sebbene le procedure stereotassica siano comuni all’interno del moderno laboratorio di neuroscienze (e ci sono diversi protocolli eccellenti che descrivono questa procedura)4,5,6, essere in grado di indirizzare in modo coerente e riproducibile regioni cerebrali discrete lungo la linea mediana (cioè l’ipotalamo mediobasale, un’area cerebrale critica per la regolazione delle funzioni omeostatiche7) presenta ulteriori sfide. Queste sfide includono l’evitare il seno sagittale superiore, il terzo ventricolo e i nuclei ipotalamici adiacenti. Inoltre, ci sono significative limitazioni spaziali all’impianto bilaterale di hardware che è necessario per gli studi di inibizione. Con queste sfide in mente, questo protocollo qui presenta una procedura modificabile per il targeting di regioni cerebrali discrete attraverso un approccio stereotassico angolato.
Protocol
Representative Results
Discussion
I recenti progressi nelle neuroscienze hanno supportato l’intuizione avanzata e la comprensione dell’attività e della funzione dei neurocircuiti cerebrali. Ciò include l’applicazione di tecnologie optogenetiche e chemiogenetiche per attivare o silenziare popolazioni neuronali discrete e i loro siti di proiezione in vivo. Più recentemente, questo ha incluso lo sviluppo di indicatori di calcio geneticamente codificati (ad esempio, GCaMP, RCaMP) e altri biosensori fluorometrici (ad esempio, dopamina, noradrenalina) per l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) concede F31-DK-113673 (C.L.F.), T32-GM-095421 (C.L.F.), DK-089056 (G.J.M.), un American Diabetes Association Innovative Basic Science Award (#1-19-IBS-192 a G.J.M.) e il Nutrition Obesity Research Center (DK-035816), Diabetes Research Center (DK-017047) e Diabetes, Obesity and Metabolism Training Grant T32 DK0007247 (T.H.M) presso l’Università di Washington.
Materials
| Fiberoptic Cannulae | Doric Lenses | MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT | Customizable |
| Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System | Kopf | Model 1900 | |
| Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge | Kopf | Model 1900-51 | |
| Kopf Model 1905 Alignment Indicator | Kopf | Model 1905 | |
| Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill | Kopf | Model 1911 | |
| Kopf Model 1915 Centering Scope | Kopf | Model 1915 | |
| Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars | Kopf | Model 1922 | |
| Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 1923-B | |
| Kopf Model 1940 Micro Manipulator | Kopf | Model 1940 | |
| Micro4 Microinjection System | World Precision Instruments | — | |
| Mouse bone screws | Plastics One | 00-96 X 1/16 | |
| Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule | Thor Labs | XCL | |
| Surgical Drill | Cell Point Scientific | Ideal Micro Drill |
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