Summary

Çok Yönlü Nörobilim Teknikleri için Uyarlanabilir Açılı Stereotaktik Yaklaşım

Published: May 07, 2020
doi:

Summary

Burada açıklanan, açılı bir koronal yaklaşım kullanarak zorlu ve ulaşılması zor beyin bölgelerini (mekansal sınırlamalar nedeniyle) hedef alabilen stereotaktik bir prosedürdür. Bu protokol hem fare hem de sıçan modellerine uyarlanabilir ve kanül implantasyonu ve viral yapıların mikroenjectionları da dahil olmak üzere çeşitli nörobilimsel uygulamalara uygulanabilir.

Abstract

Stereotaktik cerrahi, modern sinirbilim laboratuvarında önemli bir araçtır. Bununla birlikte, ulaşılması zor beyin bölgelerini tam ve doğru bir şekilde hedefleme yeteneği, özellikle orta hat boyunca beyin yapılarını hedeflerken hala bir zorluk teşkil etmektedir. Bu zorluklar arasında üstün sagittal sinüs ve üçüncü ventrikülden kaçınmak ve seçici ve ayrık beyin çekirdeklerini sürekli olarak hedefleme yeteneği yer almaktadır. Ek olarak, daha gelişmiş sinirbilim teknikleri (örneğin, optogenetik, lifli fotometri ve iki foton görüntüleme) beyne önemli donanımların hedefli implantasyonuna dayanır ve mekansal sınırlamalar yaygın bir engeldir. Burada, açılı bir koronal yaklaşım kullanılarak kemirgen beyin yapılarının stereotaktik olarak hedeflimi için değiştirilebilir bir protokol sunulmaktadır. 1) fare veya sıçan modellerine, 2) çeşitli sinirbilim tekniklerine ve 3) birden fazla beyin bölgesine uyarlanabilir. Temsili bir örnek olarak, bir optogenetik inhibisyon deneyi için fare hipotalamik ventromedial çekirdeğinin (VMN) hedeflanması için stereotaktik koordinatların hesaplanmasını içerir. Bu prosedür, adeno ilişkili bir virüsün (AAV) ışığa duyarlı bir klorür kanalını (SwiChR++) Cre’ye bağımlı bir fare modeline kodlaması ve ardından fiberoptik kanonun açılı bilateral implantasyonu ile başlar. Bu yaklaşımı kullanarak, bulgular insülin kaynaklı hipoglisemiye karşı sağlam glikoz karşı-gülatör yanıtları için VMN nöronlarının bir alt kümesinin aktivasyonunun gerekli olduğunu göstermektedir.

Introduction

Davranış, beslenme ve metabolizmanın sinirsel kontrolü, son derece karmaşık, bütünleştirici ve gereksiz nörosürücülerin koordinasyonunu içerir. Nörobilim alanının itici bir amacı, nöronal devre yapısı ve işlevi arasındaki ilişkiyi parçalamaktır. Klasik sinirbilim araçları (yani lezyonlama, lokal farmakolojik enjeksiyonlar ve elektriksel stimülasyon) davranışı ve metabolizmayı kontrol eden belirli beyin bölgelerinin rolü hakkında hayati bilgileri ortaya çıkarmış olsa da, bu araçlar özgüllük ve geri döndürülebilirlik eksikliği ile sınırlıdır1.

Nörobilim alanındaki son gelişmeler, devre fonksiyonunu yüksek mekansal çözünürlükle hücre tipi spesifik bir şekilde sorgulama ve manipüle etme yeteneğini büyük ölçüde geliştirmiştir. Örneğin optogenetik2 ve kemogenetik3 yaklaşımları, serbestçe hareket eden hayvanların genetik olarak tanımlanmış hücre tiplerinde aktivitenin hızlı ve geri dönüşümlü manipülasyonuna izin verir. Optogenetik, nöronal aktiviteyi kontrol etmek için channelrhodopsins olarak adlandırılan ışığa duyarlı iyon kanallarının kullanımını içerir. Bu tekniğin anahtarı, channelrhodopsin’in gen iletimi ve opsin’i aktive etmek için bir ışık kaynağıdır. Gen iletimi için ortak bir strateji, 1) ayrı nöronlarda Cre-rekombinaz ifade eden genetik olarak tasarlanmış fareler ve 2) Channelrhodopsin kodlaması için cre-dependent viral vektörler kombinasyonudur.

Optogenetik nöronal aktiviteyi kontrol etmek için zarif, son derece hassas bir araç sağlarken, yöntem viral vektörün başarılı stereotaktik mikroenjeksiyonuna ve tanımlanmış bir beyin bölgesine fiberoptik yerleştirmeye dayatılır. Stereotaktik prosedürler modern sinirbilim laboratuvarında yaygın olmasına rağmen (ve bu prosedürü tanımlayan birkaç mükemmel protokol vardır)4,5,6, orta hat boyunca ayrı beyin bölgelerini tutarlı ve tekrar tekrar hedefleyebilmek (yani, homeostatik fonksiyonların düzenlenmesi için kritik bir beyin alanı olan mediobaz hipotalamus) ek zorluklar sunar. Bu zorluklar arasında üstün sagittal sinüsten, üçüncü ventrikülden ve bitişik hipotalamik çekirdeklerden kaçınmak yer almaktadır. Ek olarak, inhibisyon çalışmaları için gerekli olan donanımın bilateral implantasyonunda önemli mekansal sınırlamalar vardır. Bu zorlukları göz önünde bulundurarak, bu protokol burada açılı bir stereotaktik yaklaşımla ayrı beyin bölgelerini hedeflemek için değiştirilebilir bir prosedür sunar.

Protocol

Tüm prosedürler Ulusal Sağlık Enstitüleri, Hayvanların Bakımı ve Kullanımı Rehberi uyarınca onaylandı ve washington Üniversitesi’nde hem Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) hem de Çevre Sağlığı ve Güvenliği tarafından onaylandı. 1. Açılı koordinatların hesaplanması Bir koronal beyin atlası kullanarak, hipotenüsün hedef ilgi bölgesinden geçmesi için sağ üçgeni işaretleyin. Temsili örnekte (Şekil 1), …

Representative Results

Bu protokol, hipotalamik VMN nöronlarının glisemik kontrol9’dakirolünü sorgulamak için optogenetik çalışmaları yapmak için cerrahi bir prosedürü açıklar. İlk olarak VMN’ye inhibitör bir channelrhodopsin virüsünün bilateral mikroenjeksiyon için standart (açılı olmayan) stereotaktik bir yaklaşım kullanılmıştır. Açılı bir yaklaşım da uygun olsa da, ilgi çekici beyin bölgesini hedeflemek yeterli olduğu ve kolay, güvenilir ve tutarlı bir yaklaşım olduğu için …

Discussion

Nörobilimdeki son gelişmeler, beyin nörositlerinin aktivitesi ve işlevi hakkında ileri içgörü ve anlayışı desteklemiştir. Bu, ayrık nöronal popülasyonları ve bunların projeksiyon alanlarını in vivo etkinleştirmek veya susturmak için optogenetik ve kemogenetik teknolojilerin uygulanmasını içerir. Daha yakın zamanlarda, bu, serbestçe hareket eden hayvanlarda tanımlanmış bir hücre tipinde nöronal aktivitenin in vivo kaydı için genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerinin (örneğin, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (NIDDK) tarafından F31-DK-113673 (C.L.F.), T32-GM-095421 (C.L.F.), DK-089056 (G.J.M .), Amerikan Diyabet Derneği Yenilikçi Temel Bilim Ödülü (#1-19-IBS-192’den G.J..M.)’ye) ve NIDDK destekli Beslenme Obezitesi Araştırma Merkezi (DK-035816), Diyabet Araştırma Merkezi (DK-017047) ve Diyabet, Washington Üniversitesi’nde Obezite ve Metabolizma Eğitimi T32 DK0007247 (T.H.M) hibesi.

Materials

Fiberoptic Cannulae Doric Lenses MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT Customizable
Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System Kopf Model 1900
Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge Kopf Model 1900-51
Kopf Model 1905 Alignment Indicator Kopf Model 1905
Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill Kopf Model 1911
Kopf Model 1915 Centering Scope Kopf Model 1915
Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars Kopf Model 1922
Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder Kopf Model 1923-B
Kopf Model 1940 Micro Manipulator Kopf Model 1940
Micro4 Microinjection System World Precision Instruments
Mouse bone screws Plastics One 00-96 X 1/16
Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule Thor Labs XCL
Surgical Drill Cell Point Scientific Ideal Micro Drill

References

  1. King, B. M. The rise, fall, and resurrection of the ventromedial hypothalamus in the regulation of feeding behavior and body weight. Physiology and Behavior. 87, 221-244 (2006).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  3. Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89, 683-694 (2016).
  4. Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. , e59534 (2019).
  5. Fricano-Kugler, C. J., Williams, M. R., Luikart, B., Salinaro, J. R., Li, M. Designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. , e53783 (2016).
  6. McSweeney, C., Mao, Y. Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors. Journal of Visualized Experiments. (99), e52653 (2015).
  7. Lowell, B. B. New Neuroscience of Homeostasis and Drives for Food, Water, and Salt. New England Journal of Medicine. 380, 459-471 (2019).
  8. Sidor, M. M., et al. In vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. , e51483 (2015).
  9. Faber, C. L., et al. Distinct Neuronal Projections from the Hypothalamic Ventromedial Nucleus Mediate Glycemic and Behavioral Effects. Diabetes. 67, 2518-2529 (2018).
  10. Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proceedings of the National Academy of Scences. 113, 822-829 (2016).
  11. Faber, C. L., Matsen, M. E., Meek, T. H., Krull, J. E., Morton, G. J. A customizable procedure for angled stereotaxic implantation and microinjection in the rodent brain. Kopf Carrier. 96, (2019).
  12. Correia, P., Matias, S., Mainen, Z. Stereotaxic Adeno-associated Virus Injection and Cannula Implantation in the Dorsal Raphe Nucleus of Mice. Bio-Protocol. 7, 2549 (2017).
  13. Cardozo Pinto, D. F., Lammel, S. Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating. Nature Neuroscience. 22, 1039-1041 (2019).

Play Video

Cite This Article
Faber, C. L., Matsen, M. E., Meek, T. H., Krull, J. E., Morton, G. J. Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques. J. Vis. Exp. (159), e60965, doi:10.3791/60965 (2020).

View Video