Адаптируемый угловой стереотаксический подход для универсальных методов нейробиологии
Summary
Здесь описана стереотаксическая процедура, которая может быть нацелена на сложные и труднодоступные области мозга (из-за пространственных ограничений) с использованием углового коронального подхода. Этот протокол адаптируется как к мышиным, так и к крысиным моделям и может применяться к различным нейронаучным приложениям, включая имплантацию канюли и микроинъекции вирусных конструкций.
Abstract
Стереотаксическая хирургия является важным инструментом в современной лаборатории неврологии. Тем не менее, способность точно и точно нацеливаться на труднодоступные области мозга по-прежнему представляет собой проблему, особенно при нацеливание на структуры мозга вдоль средней линии. Эти проблемы включают в себя избегание верхнего сагиттального синуса и третьего желудочка и способность последовательно нацеливаться на селективные и дискретные ядра мозга. Кроме того, более продвинутые методы нейробиологии (например, оптогенетика, волоконная фотометрия и двухфотонная визуализация) основаны на целенаправленной имплантации значительного оборудования в мозг, а пространственные ограничения являются общим препятствием. Здесь представлен модифицируемый протокол для стереотаксического нацеливания на структуры мозга грызунов с использованием углового коронального подхода. Он может быть адаптирован к 1) мышиным или крысиным моделям, 2) различным методам нейробиологии и 3) нескольким областям мозга. В качестве репрезентативного примера он включает расчет стереотаксических координат для нацеливания на гипоталамическое вентромедиальное ядро мыши (VMN) для эксперимента по оптогенетическому ингибированию. Эта процедура начинается с двусторонней микроинъекции аденоассиоциированного вируса (AAV), кодирующей светочувствительный хлоридный канал (SwiChR++), в кре-зависимую модель мыши, с последующей угловой двусторонней имплантацией волоконно-оптических канюль. Используя этот подход, результаты показывают, что активация подмножества нейронов VMN необходима для интактных контррегуляторных реакций глюкозы на инсулин-индуцированную гипогликемию.
Introduction
Нейронный контроль поведения, кормления и метаболизма включает в себя координацию очень сложных, интегративных и избыточных нейросхем. Движущей целью области нейробиологии является анализ взаимосвязи между структурой и функцией нейронной цепи. Хотя классические инструменты нейробиологии (т.е. поражения, местные фармакологические инъекции и электрическая стимуляция) раскрыли жизненно важные знания о роли конкретных областей мозга, которые контролируют поведение и метаболизм, эти инструменты ограничены отсутствием специфичности и обратимости1.
Последние достижения в области нейробиологии значительно улучшили способность опрашивать и манипулировать функцией цепи специфическим для клеточного типа способом с высоким пространственно-временным разрешением. Например, оптогенетическийподходы 2 и хемогенетическийподходы 3 позволяют быстро и обратимо манипулировать активностью у генетически определенных типов клеток свободно движущихся животных. Оптогенетика включает в себя использование светочувствительных ионных каналов, называемых канальнымиродопсинами, для контроля активности нейронов. Ключом к этой технике является доставка генов канальногородопсина и источник света для активации опсина. Общая стратегия доставки генов заключается в комбинации 1) генетически модифицированных мышей, экспрессирующих cre-recombinase в дискретных нейронах, и 2) cre-зависимых вирусных векторов, кодирующих каналродопсин.
В то время как оптогенетика обеспечивает элегантные, высокоточные средства для контроля активности нейронов, метод зависит от успешной стереотаксической микроинъекции вирусного вектора и волоконно-оптического размещения в определенной области мозга. Хотя стереотаксические процедуры являются обычным явлением в современной лаборатории нейробиологии (и существует несколько отличныхпротоколов,описывающих эту процедуру)4,5,6,способность последовательно и воспроизводимо нацеливаться на дискретные области мозга вдоль средней линии (т. Е. Медиобазальный гипоталамус, область мозга, критическая для регуляции гомеостатических функций7),представляет дополнительные проблемы. Эти проблемы включают в себя избегание верхнего сагиттального синуса, третьего желудочка и прилегающих гипоталамиальных ядер. Кроме того, существуют значительные пространственные ограничения двусторонней имплантации оборудования, которое требуется для исследований ингибирования. Имея в виду эти проблемы, этот протокол представляет собой модифицируемую процедуру нацеливания на дискретные области мозга с помощью углового стереотаксического подхода.
Protocol
Representative Results
Discussion
Последние достижения в области неврологии поддерживают продвинутое понимание и понимание активности и функции нейросхем мозга. Это включает в себя применение оптогенетических и хемогенетических технологий для активации или подавления дискретных нейронных популяций и их проекционн…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Национального института диабета и заболеваний пищеварительной системы и почек (NIDDK) F31-DK-113673 (C.L.F.), T32-GM-095421 (C.L.F.), DK-089056 (G.J.M.), Премией Американской диабетической ассоциации (#1-19-IBS-192 для G.J.M.) и финансируемым NIDDK Исследовательским центром ожирения питания (DK-035816), Центром исследований диабета (DK-017047) и диабетом, Грант на обучение ожирению и метаболизму T32 DK0007247 (T.H.M) в Вашингтонском университете.
Materials
| Fiberoptic Cannulae | Doric Lenses | MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT | Customizable |
| Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System | Kopf | Model 1900 | |
| Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge | Kopf | Model 1900-51 | |
| Kopf Model 1905 Alignment Indicator | Kopf | Model 1905 | |
| Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill | Kopf | Model 1911 | |
| Kopf Model 1915 Centering Scope | Kopf | Model 1915 | |
| Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars | Kopf | Model 1922 | |
| Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 1923-B | |
| Kopf Model 1940 Micro Manipulator | Kopf | Model 1940 | |
| Micro4 Microinjection System | World Precision Instruments | — | |
| Mouse bone screws | Plastics One | 00-96 X 1/16 | |
| Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule | Thor Labs | XCL | |
| Surgical Drill | Cell Point Scientific | Ideal Micro Drill |
References
- King, B. M. The rise, fall, and resurrection of the ventromedial hypothalamus in the regulation of feeding behavior and body weight. Physiology and Behavior. 87, 221-244 (2006).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89, 683-694 (2016).
- Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. , e59534 (2019).
- Fricano-Kugler, C. J., Williams, M. R., Luikart, B., Salinaro, J. R., Li, M. Designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. , e53783 (2016).
- McSweeney, C., Mao, Y. Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors. Journal of Visualized Experiments. (99), e52653 (2015).
- Lowell, B. B. New Neuroscience of Homeostasis and Drives for Food, Water, and Salt. New England Journal of Medicine. 380, 459-471 (2019).
- Sidor, M. M., et al. In vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. , e51483 (2015).
- Faber, C. L., et al. Distinct Neuronal Projections from the Hypothalamic Ventromedial Nucleus Mediate Glycemic and Behavioral Effects. Diabetes. 67, 2518-2529 (2018).
- Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proceedings of the National Academy of Scences. 113, 822-829 (2016).
- Faber, C. L., Matsen, M. E., Meek, T. H., Krull, J. E., Morton, G. J. A customizable procedure for angled stereotaxic implantation and microinjection in the rodent brain. Kopf Carrier. 96, (2019).
- Correia, P., Matias, S., Mainen, Z. Stereotaxic Adeno-associated Virus Injection and Cannula Implantation in the Dorsal Raphe Nucleus of Mice. Bio-Protocol. 7, 2549 (2017).
- Cardozo Pinto, D. F., Lammel, S. Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating. Nature Neuroscience. 22, 1039-1041 (2019).
