نهج مجسم زاوية قابلة للتكيف لتقنيات علم الأعصاب تنوعا
Summary
الموصوف هنا هو إجراء مجسمة التي يمكن أن تستهدف مناطق الدماغ الصعبة ويصعب الوصول إليها (بسبب القيود المكانية) باستخدام نهج تاجي الزاوية. هذا البروتوكول قابل للتكيف مع كل من نماذج الماوس والجرذان ويمكن تطبيقه على التطبيقات العصبية العلمية المتنوعة ، بما في ذلك زرع القنية والحواس الدقيقة للبنى الفيروسية.
Abstract
الجراحة المجسمة هي أداة أساسية في مختبر علم الأعصاب الحديث. ومع ذلك، فإن القدرة على استهداف مناطق الدماغ التي يصعب الوصول إليها بدقة ودقة لا تزال تمثل تحديا، لا سيما عند استهداف هياكل الدماغ على طول الخط الوسطي. وتشمل هذه التحديات تجنب الجيوب الأنفية القوس متفوقة والبطين الثالث والقدرة على استهداف باستمرار نوى الدماغ انتقائية ومنفصلة. بالإضافة إلى ذلك، تعتمد تقنيات علم الأعصاب الأكثر تقدما (مثل علم الوراثة البصرية، وقياس الألياف الضوئية، والتصوير بالفوتونين) على الزرع المستهدف للأجهزة الهامة في الدماغ، والقيود المكانية هي عائق شائع. يقدم هنا بروتوكول قابل للتعديل للاستهداف المجسم لهياكل دماغ القوارض باستخدام نهج إكليلي بزاوية. ويمكن تكييفها إلى 1) نماذج الماوس أو الفئران، 2) تقنيات علم الأعصاب المختلفة، و 3) مناطق الدماغ متعددة. وكمثال تمثيلي، يتضمن حساب الإحداثيات المجسمة لاستهداف نواة التندرومية تحت المهاد للفأرة (VMN) لتجربة تثبيط البصرية. يبدأ هذا الإجراء بالاقتصاص الدقيق الثنائي لفيروس مرتبط بال أدينو (AAV) ترميز قناة كلوريد حساسة للضوء (SwiChR ++) إلى نموذج الماوس المعتمد على Cre ، يليه زرع ثنائي الزاوية لقنية الألياف البصرية. باستخدام هذا النهج، تظهر النتائج أن تنشيط مجموعة فرعية من الخلايا العصبية VMN مطلوب للاستجابات المضادة للتنظيم الجلوكوز سليمة لنقص السكر في الدم الناجم عن الأنسولين.
Introduction
السيطرة العصبية للسلوك والتغذية والتمثيل الغذائي ينطوي على تنسيق معقدة للغاية، والتكاملية، ودوائر عصبية زائدة عن الحاجة. هدف القيادة في مجال علم الأعصاب هو تشريح العلاقة بين بنية الدائرة العصبية والوظيفة. على الرغم من أن أدوات علم الأعصاب الكلاسيكية (أي الآفات والحقن الدوائية المحلية والتحفيز الكهربائي) قد كشفت عن معرفة حيوية فيما يتعلق بدور مناطق الدماغ المحددة التي تتحكم في السلوك والتمثيل الغذائي ، إلا أن هذه الأدوات محدودة بسبب افتقارها إلى التحديد وقابلية التراجع1.
وقد حسنت التطورات الأخيرة في مجال علم الأعصاب إلى حد كبير القدرة على استجواب والتلاعب وظيفة الدائرة بطريقة محددة من نوع الخلية مع قرار كبير ملعقة الصدغية. على سبيل المثال، تسمح النهج2 و3 الكيميائية الجينية بالتلاعب السريع والناقض للنشاط في أنواع الخلايا المحددة وراثيا للحيوانات المتحركة بحرية. Optogenetics ينطوي على استخدام القنوات الأيونية الحساسة للضوء، و يطلق عليها channelrhodopsins، للسيطرة على نشاط الخلايا العصبية. مفتاح هذه التقنية هو تسليم الجينات من channelrhodopsin ومصدر للضوء لتنشيط الأوبسين. استراتيجية مشتركة لتسليم الجينات من خلال مزيج من 1) الفئران المعدلة وراثيا التعبير عن Cre-recombinase في الخلايا العصبية المنفصلة، و 2) ناقلات الفيروسية المعتمدة على الكر ترميز channelrhodopsin.
في حين أن optogenetics يوفر وسيلة أنيقة ودقيقة للغاية للسيطرة على نشاط الخلايا العصبية ، فإن هذه الطريقة تعتمد على التجميل المجسم الناجح للناقل الفيروسي ووضع الألياف البصرية في منطقة محددة في الدماغ. على الرغم من أن الإجراءات المجسمة شائعة داخل مختبر علم الأعصاب الحديث (وهناك العديد من البروتوكولات الممتازة التي تصف هذا الإجراء)4،5،6، أن تكون قادرة على استهداف مناطق الدماغ المنفصلة باستمرار وعلى نحو مستنسخ على طول الخط الوسطي (أي تحت المهاد المتوسط ، وهي منطقة دماغ حاسمة لتنظيم الوظائف المنزلية7)يمثل تحديات إضافية. وتشمل هذه التحديات تجنب الجيوب الأنفية القوس متفوقة, البطين الثالث, والنوى تحت المهاد المجاورة. وبالإضافة إلى ذلك، هناك قيود مكانية كبيرة لزرع ثنائي للأجهزة المطلوبة لدراسات تثبيط. مع وضع هذه التحديات في الاعتبار ، يقدم هذا البروتوكول هنا إجراء قابلا للتعديل لاستهداف مناطق الدماغ المنفصلة من خلال نهج مجسم بزاوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد دعمت التطورات الأخيرة في علم الأعصاب البصيرة المتقدمة والفهم في نشاط ووظيفة الدوائر العصبية في الدماغ. ويشمل ذلك تطبيق التكنولوجيات البصرية والكيموجينية لتنشيط أو إسكات مجموعات الخلايا العصبية المنفصلة ومواقع الإسقاط الخاصة بها في الجسم الحي. وفي الآونة الأخيرة، شمل ذلك تطوير مؤشر?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (NIDDK) منح F31-DK-113673 (C.L.F.) و T32-GM-095421 (C.L.F.) وDK-089056 (G.J.M #1-19-IBS-192 إلى G.J.M)ومركز أبحاث السمنة الغذائية الممول من NIDDK (DK-035816) ومركز أبحاث السكري (DK-017047) ومرض السكري، منحة التدريب على السمنة والتمثيل الغذائي T32 DK0007247 (T.H.M) في جامعة واشنطن.
Materials
| Fiberoptic Cannulae | Doric Lenses | MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT | Customizable |
| Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System | Kopf | Model 1900 | |
| Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge | Kopf | Model 1900-51 | |
| Kopf Model 1905 Alignment Indicator | Kopf | Model 1905 | |
| Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill | Kopf | Model 1911 | |
| Kopf Model 1915 Centering Scope | Kopf | Model 1915 | |
| Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars | Kopf | Model 1922 | |
| Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 1923-B | |
| Kopf Model 1940 Micro Manipulator | Kopf | Model 1940 | |
| Micro4 Microinjection System | World Precision Instruments | — | |
| Mouse bone screws | Plastics One | 00-96 X 1/16 | |
| Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule | Thor Labs | XCL | |
| Surgical Drill | Cell Point Scientific | Ideal Micro Drill |
References
- King, B. M. The rise, fall, and resurrection of the ventromedial hypothalamus in the regulation of feeding behavior and body weight. Physiology and Behavior. 87, 221-244 (2006).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89, 683-694 (2016).
- Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. , e59534 (2019).
- Fricano-Kugler, C. J., Williams, M. R., Luikart, B., Salinaro, J. R., Li, M. Designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. , e53783 (2016).
- McSweeney, C., Mao, Y. Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors. Journal of Visualized Experiments. (99), e52653 (2015).
- Lowell, B. B. New Neuroscience of Homeostasis and Drives for Food, Water, and Salt. New England Journal of Medicine. 380, 459-471 (2019).
- Sidor, M. M., et al. In vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. , e51483 (2015).
- Faber, C. L., et al. Distinct Neuronal Projections from the Hypothalamic Ventromedial Nucleus Mediate Glycemic and Behavioral Effects. Diabetes. 67, 2518-2529 (2018).
- Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proceedings of the National Academy of Scences. 113, 822-829 (2016).
- Faber, C. L., Matsen, M. E., Meek, T. H., Krull, J. E., Morton, G. J. A customizable procedure for angled stereotaxic implantation and microinjection in the rodent brain. Kopf Carrier. 96, (2019).
- Correia, P., Matias, S., Mainen, Z. Stereotaxic Adeno-associated Virus Injection and Cannula Implantation in the Dorsal Raphe Nucleus of Mice. Bio-Protocol. 7, 2549 (2017).
- Cardozo Pinto, D. F., Lammel, S. Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating. Nature Neuroscience. 22, 1039-1041 (2019).
