我々は、胚性幹細胞から生成された胚体における高スループットシーケンシングに続く定量染色体立体構造捕捉の適用を報告する。この技術は、胚性幹細胞分化中に所定の遺伝子の推定エンハンサーとプロモーター領域との接触を同定し、定量することを可能にする。
哺乳類の開発中、細胞の運命は、遺伝子発現の特異性、タイミング、および空間パターンを定義する規制ネットワークの確立を通じて決定される。多能性幹細胞由来の胚体(EBs)は、主な3つの生殖層の分化を研究し、細胞運命指定時に調節回路を定義する一般的なモデルとなっている。組織特異的エンハンサーがプロモーターと相互作用することによってこれらのネットワークで重要な役割を果たしていることはよく知られていますが、関連する標的遺伝子に割り当てることはまだ困難です。これを可能にするために、開発中のエンハンサー・プロモーター接触とそのダイナミクスを研究するために定量的アプローチが必要です。ここでは、EB分化モデルにおける同精促進剤とのエンハンサーおよびその接触を定義する4C法を適合させました。この方法では、頻繁に切断制限酵素、超音波処理、およびネストライゲーション媒介PCRプロトコルを、市販のDNAライブラリ調製キットと互換性のある使用します。続いて、4Cライブラリはハイスループットシーケンシングを行い、バイオインフォーマット的に分析され、選択されたプロモーターとの接触を有するすべての配列の検出と定量が可能になる。結果のシーケンシングデータは、分化中のエンハンサー・プロモーター接触のダイナミクスに関する情報を得るためにも使用することができる。EB 分化モデルに関して説明されている手法は、簡単に実装できます。
マウスでは、3.5日齢の胚の内細胞塊(ICM)は、胚多能性幹細胞を含む。ICMはさらに4.5日目にエピブラストに発展し、胚の主な3つの胚層である外胚、中胚、および内胚細胞を生成する。ICM内の多能性細胞は生体内に一過性しか存在しないが、マウス胚性幹細胞(mESC)1、2、3の樹立により1,2,3培養中に捕捉することができる。mESCは未分化状態のままで無限に増殖するが、内因的および外因性刺激の際には、多能性状態を抜け出し、3つの発達生殖層22、44の細胞を生成することもできる。興味深いことに、小さな液滴で懸濁液中で培養すると、mESCは3つの胚層5のすべてに分化する3次元凝集体(すなわち、EB)を形成する。EB形成アッセイは、初期の系統指定プロセスを研究するための重要なツールです。
系統指定の間、各生殖層の細胞は特定の遺伝子発現プログラム4を獲得する。遺伝子の正確な時空間的発現は、コアプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、および絶縁,体6、7、8、97を含む多様6なシス調節要素によって調節される。8,9エンハンサーは、典型的には数百塩基対にまたがる調節DNAセグメント、組織特異的遺伝子発現8を調整する。エンハンサーは、局所クロマチン構造88,1010を調節する転写因子および補因子との結合によって活性化または沈黙される。推定エンハンサーを同定するために一般的に使用される技術は、ゲノム全体のクロマチン免疫沈降とそれに続くシーケンシング(ChIP-seq)、およびシーケンシング(ATAC-seq)技術を用いたトランスポザーゼ対応クロマチンのアッセイである。したがって、活性エンハンサーは、特定の活性ヒストンマークと増加局所DNAアクセシビリティ1111、12、13、1412,13,によって特徴付けられる。さらに、発達促進剤は、その同精促進剤88,99との物理的相互作用を必要とすると考えられている。実際に、エンハンサー・プロモーターの接触を妨害するエンハンサー変異体および欠失が発達奇形15を引き起こす可能性が示されている。そのため、発達遺伝子発現を制御する機能エンハンサーの同定に関する付加的な情報を提供する新しい技術が必要とされている。
染色体立体構造捕捉(3C)技術16の開発以来、染色体接触のマッピングは、調節要素間の物理的距離を評価するために集中的に使用されてきた。重要なことに、3C技術のハイスループット変異体が最近開発され、クロマチン断片17間の接触の固定、消化、結紮、および回復のための異なる戦略を提供する。中でも、Hi-Cの中ではゲノムワイド18の3Cライゲーション製品のシーケンシングを可能にする一般的な技術となっている。しかし、エンハンサー・プロモーター接触の分析に適した解像度に達するために必要な高いシーケンシングコストは、この技術を特定の遺伝子座の研究には現実的でありません。したがって、より高,い解像度19、20、21、2220,21で標的座を分析する代替方法が開発された。1922これらの方法の1つ、すなわち4Cは、1対全戦略として知られており、視点として選択されたサイトに接触するすべてのシーケンスを検出することができます。しかし、標準4C技術の欠点は、必要な逆PCRであり、異なるサイズの断片を増幅し、小さな製品を支持し、ハイスループットシーケンシング後のバイアス定量化である。近年、UMI-4Cは、この問題23を回避する定量的および標的染色体接触プロファイリング用に、一意の分子識別子(UMI)を用いた4C技術の新しい変形が開発されている。このアプローチでは、頻繁なカッター、超音波処理、およびネストライゲーション媒介PCRプロトコルを使用し、比較的均一な長さの分布を有するDNA断片の増幅を伴う。この均質性は、短い配列のためのPCRの好みの増幅プロセスにおけるバイアスを低減し、空間的に接続された分子/断片の効率的な回復および正確なカウントを可能にする。
ここでは、EB 分化中のリネージュ有益な転写因子のプロモーターとエンハンサー間のクロマチン接触を同定および定量するために UMI-4C 技術を適応させるプロトコルについて説明する。
吊り落とし培養法は、追加の増殖因子やサイトカインを必要とせず、予め所定数のmESCs5からEBの均質集団を再現的5に生成する。ここでは、EB分化モデルにおける系統特異的転写因子のエンハンサー・プロモーター接触を定量化するUMI-4Cアプローチから適応した定量4Cのプロトコルについて説明する。EB分化中にPou5f1およびT遺伝子のプロモーターに接触するクロマチン領域を動的に同定した。POU5f1は、EB分化中にダウンレギュレートされ、Pou5f1プロモーターとその遠位エンハンサーとの接触頻度が減少した。逆に、Eb分化中にTをアップレギュレートし、プロモーターとの接触周波数が減少する3つのエンハンサーを同定した(図3)。同定を確認するために、活性ヒストンマークH3K27acのクロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイを24を行うことができるが、このヒストンマークがインアクティベート11の間に増強活性化と関連することが示されており、エンハンサーがこのマークを失う。
標準の4C技術は、特定のゲノム部位25のクロマチン接触プロファイルを調査するために広く使用されている。しかし、PCRフラグメントサイズの不均一性によってもたらされる偏りやPCR重複を区別できないため、このアプローチは、広範な正規化26、27、2828の後でも定量的に解釈することは困難です。26,27我々の定量4C法は、従来の4Cアプローチ23の制限を回避するために超音波処理およびネストライゲーション媒介PCRステップを用いて単一分子の定量を可能にするUMI-4C技術とほぼ同一である。しかし、一意の分子識別子を使用するUMI-4Cとは異なり、当社の定量4Cプロトコルは、超音波処理ステップによって生成された特異的DNA破断に基づいて単一分子の定量を可能にします。当社のプロトコルは、市販のDNAライブラリ調製キットと互換性を持ち、固有の分子識別子を持つプライマーの必要性を排除します。
私たちのプロトコルは考慮されるべきいくつかの重要なステップを含みます。古典的な4C法28と同様に、我々のプロトコルの重要な要因は、3C分子の調製中の消化および結紮の効率である。低い消化/結紮効率は、目的の断片との相互作用の複雑さを劇的に減少させ、その結果、分解能を低下させる可能性があります。先に説明した23のように、プロトコルのもう一つの重要なステップは、ライブラリ増幅のためのプライマーの設計である。第2のPCR反応プライマーは、尋問された制限部位から5〜15ntに配置されるべきである。75 nt シーケンス読み込みでは、マッピング用のキャプチャ長の残り 40 nt 以上が可能になります。最初のPCR反応で使用されるプライマーは、重なりのない第2プライマーの上流に設計されるべきであり、両方とも効率的なDNA増幅を確実にするのに十分な特異的であるべきである。多重化の場合、プライマーは、60〜65°Cの融解温度(Tm)を目指して、独立して設計する必要があります。また、他の3C技術については、定量4C法の分解能は、プロトコル25で用いられる制限酵素によって決定される。このプロトコルは、4 bp認識部位MboIを有する制限酵素を使用する。この酵素の最大分解能は約500bpですが、これは非常に遺伝子組み込みであり、めったに達成されません。別の制限は、同じ制限フラグメント内にある要素間で発生する相互作用は検出できないことです。さらに、1つの制限部位の距離で発生する相互作用は、未消化の背景と区別することはできません。結紮前の充填工程を使用すると、これらの相互作用の検出が可能になる可能性があります。
定量4Cは、標的座のクロマチン接触を尋問するのに理想的である。ただし、特定の PCR 増幅ステップでは、同時に調査できる遺伝子数が制限されます。標的遺伝子数を増やす方法は、PCRステップを多重化して複数のターゲットを同時に増幅することですが、実装前に使用されるプライマーの互換性とテストが必要です。プロモーターにおけるクロマチンアーキテクチャのグローバルな変化が望ましい場合、Hi-C、PC Hi-C、またはHiChIPのようなゲノム全体のアプローチは、より適切な29、30、3130,31であろう。29
The authors have nothing to disclose.
F・ル・ディリー、R・シュタトゥーダーズ、グラーフ研究所のメンバーの皆さんに、助言と議論に感謝します。G.S.はマリー・スクロドフスカ・キュリー・フェローシップ(H2020-MSCA-IF-2016、miRStem)、T.V.Tはフアン・デ・ラ・シエルバポスドク・フェローシップ(MINECO、FJCI-2014-22946)によって支えられました。この研究は、第7回枠組みプログラムFP7(ERCシナジーグラント4Dゲノム、T.G.への助成金契約609989)、スペイン経済産業競争力省(MEIC)、EMBLパートナーシップ、セントロ・デ・エクセレンシア・セベロ・オチョア2013-2017およびCERCAプログラムジェネラリタ・デ・カタルーニャの下で欧州研究評議会によって支持されました。
0.1% EmbryoMax gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | Cell culture |
0.25% Trypsin-EDTA | 25200072 | ||
AMPure XP | Beckman Coulter | 10136224 | 4C/DNA purification |
B27 supplement | Gibco | 17504044 | Cell culture |
Beta-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | Cell culture |
Bioruptor Pico | Diagencode | B01060010 | 4C/sonication |
BSA | NEB | B9000S | 4C |
CHIR99021 | Selleck Chemicals | S1263 | Cell culture |
CIP | NEB | M0212 | 4C |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | 4C |
DMEM/F12 medium | Gibco | 11320033 | Cell culture |
dNTP | NEB | N0447S | 4C |
ESGRO Leukaemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1107 | Cell culture |
Formaldehyde solution (37%) | Sigma | 252549-25ML | 4C |
Glycin | Sigma | GE17-1323-01 | 4C |
Glycogen | ThermoFischer | R0551 | 4C |
Herculase II Fusion DNA polymerase | Agilent | 600675 | 4C |
IGEPAL CA-630 | Sigma | I3021-50ML | 4C |
Knockout DMEM | 10829018 | ||
L-glutamine | Gibco | 25030081 | Cell culture |
MboI | NEB | R0147M | 4C |
MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | Cell culture |
N2 supplement | Gibco | A1370701 | Cell culture |
NEBNext DNA Library prep | NEB | E6040 | 4C |
NEBuffer 2.1 | NEB | B7202S | 4C/digestion |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Cell culture |
PD0325901 | Selleck Chemicals | S1036 | Cell culture |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
Proteinase K | NEB | P8107S | 4C |
Qubit 4 Fluorometer | ThermoFischer | Q33238 | 4C |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFischer | Q32851 | 4C |
RNase A | ThermoFischer | EN0531 | 4C |
Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360070 | Cell culture |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Cell culture |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | 4C |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | M0202M | 4C |