אנו מדווחים על היישום של לכידת כרומוזום קונפורמציה כמותי ואחריו רצף תפוקה גבוהה בגופים embryoid שנוצרו בתאי גזע עובריים. טכניקה זו מאפשרת לזהות ולכמת את אנשי הקשר בין משפרי ואזורים היזם של גן נתון במהלך הבידול תא גזע עובריים.
במהלך התפתחות היונקים, גורלות התאים נקבעים באמצעות הקמת רשתות רגולטוריות המגדירות את הפירוט, התזמון ודפוסי המרחב של הביטוי הגנטי. Embryoid גופים (בס) נגזר בתאי גזע פלאוריטי כבר מודל פופולרי ללמוד את הבידול של שלושת החיידקים העיקריים שלוש להגדיר מעגלים הרגולציה במהלך מפרט הגורל התא. למרות שידוע כי משפרי רקמות ספציפיות לשחק תפקיד חשוב ברשתות אלה על ידי אינטראקציה עם יזמים, הקצאת אותם גנים היעד הרלוונטיים שלהם עדיין נשאר מאתגרת. כדי להפוך את זה לאפשרי, גישות כמותיים נדרשות כדי ללמוד אנשי קשר של משפר-יזם והדינמיקה שלהם במהלך הפיתוח. כאן, הותאמו שיטת 4c כדי להגדיר משפרי ואנשי הקשר שלהם עם היזמים קנצוני במודל בידול EB. השיטה משתמשת בתדירות גבוהה לחיתוך אנזימים הגבלה, sonication, ופרוטוקול בתיווך מקונן-PCR התואם לערכות הכנה לספריות DNA מסחריות. לאחר מכן, ספריות 4C נתונים ברצף תפוקה גבוהה ומנותח ביולוגי, המאפשר זיהוי וכימות של כל הרצפים שיש להם קשרים עם מקדם נבחר. ניתן גם להשתמש בנתוני הרצף המתקבל לקבלת מידע אודות הדינמיקה של אנשי קשר של משפר-יזם במהלך בידול. הטכניקה המתוארת עבור מודל בידול EB קל ליישום.
בעכברים, מסת התא הפנימי (ICM) של עוברי 3.5-יום בן מכיל תאי גזע מעובריים מתחלקים. ICM מתפתח עוד לתוך אפיפיצוץ ביום 4.5, הפקת עור, מזועור, ותאי עור אנדובית, שלוש שכבות הנבט הראשי בעובר. למרות התאים החזקים pluripotent ICM קיימים רק בvivo, הם יכולים להיות שנתפסו בתרבות על ידי הקמת תאים גזע עובריים של העכבר (mESCs)1,2,3. MESCs להישאר במצב מובחן מתרבים ללא הגבלת זמן, עדיין על גירויים פנימיים וחיצוניים הם גם מסוגלים לצאת המדינה pluripotency וליצור תאים של שלוש שכבות הנבט ההתפתחותי2,4. מעניין, כאשר תרבותי בהשעיה של טיפות קטנות, mESCs טופס שלוש מימדי (כלומר, בס) כי להבדיל בין שלוש שכבות הנבט5. שיטת היווצרות EB היא כלי חשוב לחקר התהליך המוקדם של מפרט השושלת.
במהלך מפרט השושלת, התאים של כל שכבת נבט לרכוש מסוים ביטוי גנים התוכנית4. הביטוי הזמני המדויק של הגנים מוסדר על ידי רכיבי cis-רגולטוריות שונים, כולל היזמים הליבה, משפרי, משתיקי, ומבודד בידוד6,7,8,9. משפרי, מקטעי ה-DNA רגולציה בדרך כלל פורש כמה מאות זוגות בסיס, קואורדינטות ביטוי גנטי ספציפי לרקמות8. משפרי הפעלה או מושתקים באמצעות קשירה של גורמי שעתוק וקופנים המסדירים את מבנה הכרוטין המקומי8,10. טכניקות בשימוש נפוץ כדי לזהות משפרי באמצעות הגנום כרומטין immunoprecipitation ואחריו ברצף (שבב-seq) ואת הערך עבור כרומטוטין נגיש באמצעות רצף (ATAC-seq) טכניקות. לפיכך, משפרי פעילים מאופיינים בסימני היסטון מסוימים, על ידי הגדלת הנגישות המקומית DNA11,12,13,14. בנוסף לכך, משפרי התפתחותיות מחייבות אינטראקציה פיזית עם היזם קנצוני שלהם8,9. אכן, זה הוכח כי שיפור משתנים ומחיקות אשר משבש את הקשר משפר-יזם יכול להוביל מומים התפתחותיים15. לכן, יש צורך בטכניקות הרומן המספקות מידע נוסף לזיהוי משפרי תפקוד השולטים בביטוי הגן ההתפתחותי.
מאז התפתחות של לכידת כרומוזום היווצרות (3C) שיטה16, מיפוי של אנשי קשר כרומוזומים נעשה שימוש אינטנסיבי כדי להעריך את המרחק הפיזי בין אלמנטים הרגולציה. חשוב מאוד, גרסאות תפוקה גבוהה של טכניקות 3C פותחו לאחרונה, מתן אסטרטגיות שונות לקיבוע, עיכול, התקשרות, והתאוששות של אנשי קשר בין שברי כרומטין17. ביניהם, באתרו ההיי-C הפך טכניקה פופולרית המאפשרת רצף של 3C מוצרים הקשור הגנום-רחב18. עם זאת, עלויות הרצף הגבוה הדרושות כדי להגיע לרזולוציה המתאימה לניתוח של משפר ומקדם הקשר הופך טכניקה זו מעשית לחקר הבית המסוים. לכן פותחו שיטות אלטרנטיביות לניתוח המקום המיועד ברזולוציה גבוהה יותר19,20,21,22. אחת מהשיטות הללו, כלומר 4C, הידועה כאחת לעומת כל האסטרטגיה, מאפשרת זיהוי של כל הרצפים לפנות לאתר שנבחר כנקודת המבט. עם זאת, חיסרון של הטכניקה הסטנדרטית 4C הוא ה-PCR ההופכי הנדרש, אשר מגביר שברים בגודל שונה, העדפה מוצרים קטנים וכימות ממתח לאחר רצף התפוקה הגבוהה. לאחרונה, UMI-4C, גרסה חדשה של הטכניקה 4C באמצעות מזהים מולקולריים ייחודיים (UMI) פותחה עבור כמותית וממוקדת ממוקד הפרופיל קשר שחוסם את הבעיה23. גישה זו משתמשת בחותכי תכופים, sonication, ובפרוטוקול הפצה מקוננת-PCR, ובכך מעורבים הגברה של שברי דנ א עם הפצת אורך אחיד יחסית. הומוגניות מפחיתה את הביסים בתהליך הגברה של העדפות ה-PCR לרצפים קצרים יותר ומאפשרת החלמה יעילה וספירה מדויקת של מולקולות/קטעים המחוברים באופן מדויק.
כאן אנו מתארים פרוטוקול אשר מתאים את טכניקת UMI-4C כדי לזהות ולכמת את הקשר בין היזמים ומשפרי השושלת האלף לימודיים שעתוק גורמים במהלך בידול EB.
שיטת שחרור תלוי התרבות אינה זקוקה לגורמי גדילה נוספים או ציטוקינים והוא מייצר אוכלוסיות הומוגנית של בס מ מספר קבוע מראש של mESCs5. כאן אנו מתארים פרוטוקול של 4C כמותי המותאם מהגישה UMI-4C כדי לכמת משפר את הקשר של השושלת שעתוק גורמים ספציפיים במודל בידול EB. זיהינו אזורי כרומטין שיצרו קשר עם היזמים של Pou5f1 ו- T גנים בצורה דינמית בזמן בידול EB. Pou5f1 היה מוסדר במהלך בידול EB ואת תדר הקשר בין היזם Pou5f1 ואת העצם המרוחק שלה ירד. לעומת זאת, T היה upregulated במהלך בידול EB וזיהינו שלושה משפרי אשר הקשר תדרים עם היזם שלהם הם ירדו (איור 3). כדי לאשר את הזיהוי, כרומטין immunoprecipitation (שבב) היצע של מארק היסטון פעיל H3K27ac ניתן לבצע24, כמו זה מארק היסטון הוכח להיות קשור עם הפעלת ומשפרי משפר לאבד את הסימון במהלך ההפעלה שלהם11.
טכניקת 4C סטנדרטית היתה בשימוש נרחב כדי לסקור את פרופיל הקשר של כרומטין של אתרים גנומית ספציפיים25. עם זאת, גישה זו קשה לפענוח כמותית גם לאחר נורמליזציה נרחבת26,27, 28 בגלל28 הביסים שהוצגו על ידי טרוגניות הגודל של ה-pcr והבלתי אפשרי להבחין בין PCR כפילויות. שיטת 4C כמותיים שלנו היא זהה במידה רבה לטכניקת UMI-4C המאפשרת כימות של מולקולות יחיד באמצעות sonication ו-מקונן-ליפעה מתווכת-PCR צעד כדי לעקוף את המגבלה של הגישה הקלאסית 4C23. עם זאת, בניגוד ל-UMI-4C המשתמשת במזהים מולקולריים ייחודיים, פרוטוקול 4C כמותי שלנו מאפשר את כימות המולקולות היחידות המבוססות על הפסקת ה-DNA הספציפית שמפיק השלב הsonication. זה הופך את הפרוטוקול שלנו תואם ערכות ה-DNA מסחרי הכנת הספריות, ברור את הצורך של התחל עם מזהים מולקולרית ייחודי.
הפרוטוקול שלנו כולל כמה צעדים מרכזיים שיש לשקול. כמו בשיטה 4C קלאסית28, גורמים קריטיים של הפרוטוקול שלנו הם היעילות של העיכול והארכה במהלך הכנת מולקולות 3c. העיכול הנמוך/יעילות החיבור יכול להקטין באופן דרמטי את המורכבות של האינטראקציה עם קטע של עניין, וכתוצאה מכך רזולוציה מופחתת. כפי שתוארה בעבר23, צעד קריטי נוסף של הפרוטוקול הוא עיצוב התחל של הגברה הספריה. במקום הראשון של תגובת ה-PCR יש למקם 5-15 nt מאתר ההגבלה שנחקר. לקריאה ברצף של 75 nt, הדבר מאפשר לפחות 40 nt שמאל של אורך הלכידה למיפוי. התחל בשימוש התגובה ה-PCR הראשון צריך להיות מעוצב במעלה הזרם של התחל השני עם חפיפה לא ושניהם צריכים להיות ספציפיים מספיק כדי להבטיח הגברה יעילה DNA. עבור ריבוב, התחל צריך להיות מתוכנן באופן עצמאי, מכוון טמפרטורת ההיתוך (Tm) של 60-65 ° c. יתר על כן, כמו עבור טכניקות 3C אחרות, הרזולוציה של שיטת 4C כמותית נקבעת על ידי אנזים ההגבלה המשמש בפרוטוקול25. פרוטוקול זה משתמש באנזים הגבלה עם אתר זיהוי של 4 bp, MboI. הרזולוציה המקסימלית עם אנזים זה הוא סביב 500 bp, אבל זה תלוי מאוד לוקוס ולעתים רחוקות מושגת. מגבלה נוספת היא שאינטראקציות המתרחשות בין רכיבים הממוקמים באותו קטע מגבלה אינן מזהות. בנוסף, אין אפשרות להבדיל בין אינטראקציות המתרחשות במרחק של אתר מגבלה אחד לבין הרקע שאינו מתעכל. השימוש בצעד מילוי לפני הארכה עשוי לאפשר זיהוי של אינטראקציות אלה.
4C כמותי מתאים באופן אידיאלי לחקור מגעים כרומטין של המיקום המיועד. עם זאת, צעד הגברה מסוים של ה-PCR מגביל את מספר המקום שניתן לחקור בו זמנית. דרך להגדיל את מספר המקום המיועד היא להתאים את שלבי ה-PCR כדי להגביר בו מספר מטרות, אבל זה דורש תאימות של התחל בשימוש ובדיקת כל זוג פריימר לפני היישום. אם השינויים הגלובליים של אדריכלות כרומטין על היזמים הם הרצויים, הגנום רחב גישות כגון היי-c, PC Hi-c, או hichip יהיה המתאים יותר29,30,31.
The authors have nothing to disclose.
אנחנו רוצים להודות ל ‘ לה דילי, ר. שטהודרס וחברי המעבדה של גראף על העצות והדיונים שלהם. G.S. היה נתמך על ידי מלגת מארי Sklodowska-קירי (H2020-מסקה-IF-2016, miRStem), T. V. T על ידי מלגת חואן דה לה Cierva (MINECO, FJCI-2014-22946). עבודה זו נתמכת על ידי מועצת המחקר האירופי תחת תכניתהמסגרת ה -7 FP7 (Erc סינרגיה הגראנט 4d-הגנום, גרנט הסכם 609989 ל ת גבהים), משרד הכלכלה הספרדי, תעשייה ותחרותיות (meic) לשותפות Embl, סנטרו דה Excel מרכז אוצ’ואה 2013-2017 ו Cerca תוכנית הכלטאת דה קטלוניה.
0.1% EmbryoMax gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | Cell culture |
0.25% Trypsin-EDTA | 25200072 | ||
AMPure XP | Beckman Coulter | 10136224 | 4C/DNA purification |
B27 supplement | Gibco | 17504044 | Cell culture |
Beta-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | Cell culture |
Bioruptor Pico | Diagencode | B01060010 | 4C/sonication |
BSA | NEB | B9000S | 4C |
CHIR99021 | Selleck Chemicals | S1263 | Cell culture |
CIP | NEB | M0212 | 4C |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | 4C |
DMEM/F12 medium | Gibco | 11320033 | Cell culture |
dNTP | NEB | N0447S | 4C |
ESGRO Leukaemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1107 | Cell culture |
Formaldehyde solution (37%) | Sigma | 252549-25ML | 4C |
Glycin | Sigma | GE17-1323-01 | 4C |
Glycogen | ThermoFischer | R0551 | 4C |
Herculase II Fusion DNA polymerase | Agilent | 600675 | 4C |
IGEPAL CA-630 | Sigma | I3021-50ML | 4C |
Knockout DMEM | 10829018 | ||
L-glutamine | Gibco | 25030081 | Cell culture |
MboI | NEB | R0147M | 4C |
MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | Cell culture |
N2 supplement | Gibco | A1370701 | Cell culture |
NEBNext DNA Library prep | NEB | E6040 | 4C |
NEBuffer 2.1 | NEB | B7202S | 4C/digestion |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Cell culture |
PD0325901 | Selleck Chemicals | S1036 | Cell culture |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
Proteinase K | NEB | P8107S | 4C |
Qubit 4 Fluorometer | ThermoFischer | Q33238 | 4C |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFischer | Q32851 | 4C |
RNase A | ThermoFischer | EN0531 | 4C |
Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360070 | Cell culture |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Cell culture |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | 4C |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | M0202M | 4C |