Embriyonik kök hücrelerden üretilen embriyoid cisimlerde yüksek iş eldeli sıralamanın ardından kantitatif kromozom konformasyon yakalama uygulamasını rapor ediyoruz. Bu teknik, embriyonik kök hücre farklılaşması sırasında belirli bir genin putatif arttırıcılar ve promotör bölgeleri arasındaki temasları tanımlamaya ve quantitate sağlar.
Memeli gelişimi sırasında hücre kaderleri gen ekspresyonunun özgüllüğünü, zamanını ve mekansal desenlerini tanımlayan düzenleyici ağların kurulması yla belirlenir. Pluripotent kök hücrelerden elde edilen embriyoid cisimler (EBs) ana üç mikrop tabakasının farklılaşmasını incelemek ve hücre kader belirtimi sırasında düzenleyici devreleri tanımlamak için popüler bir model olmuştur. Dokuya özgü arttırıcıların organizatörlerle etkileşimkurarak bu ağlarda önemli bir rol oynadığı iyi bilinmesine rağmen, bunları ilgili hedef genlerine atamak hala zor olmaya devam etmektedir. Bunu mümkün kılmak için, geliştirme sırasında artırıcı-organizatör kişileri ve dinamiklerini incelemek için nicel yaklaşımlara ihtiyaç vardır. Burada, eb farklılaştırma modelinde güçlendiricileri ve bilişli organizatörlerle olan bağlantılarını tanımlamak için bir 4C yöntemi ni uyarladık. Yöntem sık sık kesme kısıtlama enzimleri, sonication ve bir iç içe-ligasyon aracılı PCR protokolü ticari DNA kütüphane hazırlama kitleri ile uyumlu kullanır. Daha sonra, 4C kitaplıkları yüksek iş sahibi sıraya tabi tutulur ve biyoinformatically analiz, algılama ve seçilen bir organizatör ile temas tüm dizileri niceliksel izin. Elde edilen sıralama verileri, farklılaşma sırasında artırıcı-organizatör kişilerin dinamikleri hakkında bilgi edinmek için de kullanılabilir. EB farklılaştırma modeli için açıklanan tekniği uygulamak kolaydır.
Farelerde, 3,5 günlük embriyoların iç hücre kütlesi (ICM) embriyonik pluripotent kök hücreler içerir. ICM daha fazla gün 4.5 epiblast içine gelişir, ektoderm üreten, mezoderm, ve endoderm hücreleri, embriyo ana üç mikrop katmanları. ICM pluripotent hücreler sadece geçici in vivo var olmasına rağmen, onlar fare embriyonik kök hücrelerin kurulması ile kültür yakalanabilir (mESCs)1,2,3. MESC’ler farklılaşmamış bir durumda kalır ve süresiz olarak çoğalır, ancak içsel ve dışsal uyaranlarla aynı zamanda pluripotency durumundan çıkma ve üç gelişimselmikroptabakasının 2,4üreten hücreleri üretme yeteneğine sahiptirler. İlginçtir, küçük damlacıklar süspansiyon kültürlü, MM’ler üç boyutlu agregalar formu (yani, EBs) her üçmikropkatmanları 5 ayırt . EB formasyon uyrağı, erken soy spesifikasyon sürecini incelemek için önemli bir araçtır.
Soy belirtimi sırasında, her mikrop tabakasının hücreleri belirli bir gen ekspresyonu programı4elde. Genlerin kesin spatiotemporal ekspresyonu, çekirdek organizatörleri, arttırıcılar, susturucular ve yalıtkanlar6,,7,8,9dahil olmak üzere çeşitli cis-düzenleyici unsurlar tarafından düzenlenir. Arttırıcılar, düzenleyici DNA segmentleri genellikle birkaç yüz baz çiftleri kapsayan, dokuya özgü gen ekspresyonu koordine8. Arttırıcılar aktive edilir veya transkripsiyon faktörleri ve yerel kromatin yapısını düzenleyen kofaktör bağlanması ile susturulur8,10. Putatif arttırıcıları tanımlamak için yaygın olarak kullanılan teknikler genom çapında kromatin immünopresidiplitve ardından sıralama (ChIP-seq) ve sıralama (ATAC-seq) teknikleri kullanılarak transposaz erişilebilir kromatin için titreşmedir. Böylece, aktif arttırıcılar belirli aktif histon işaretleri ve artan yerel DNA erişilebilirliğiile karakterizedir 11,12,13,14. Buna ek olarak, gelişimsel arttırıcılar kendi cognate organizatörü ile fiziksel etkileşim gerektiren inanılmaktadır8,9. Gerçekten de, artırıcı-organizatör temasları bozan artırıcı varyantları ve silmelerin gelişimsel malformasyonlara yol açabileceği gösterilmiştir15. Bu nedenle, gelişimsel gen ekspresyonunu kontrol eden fonksiyonel arttırıcıların tanımlanması için ek bilgi sağlayan yeni teknikler için ihtiyaç vardır.
Kromozom konformasyon yakalama (3C) tekniğinin geliştirilmesinden bu yana16,kromozom kontaklarının haritalaması düzenleyici unsurlar arasındaki fiziksel mesafeyi değerlendirmek için yoğun bir şekilde kullanılmıştır. Daha da önemlisi, 3C tekniklerinin yüksek iş sahibi varyantları son zamanlarda geliştirilmiştir, fiksasyon için farklı stratejiler sağlayan, sindirim, ligasyon, ve kromatin parçaları arasındaki temasların kurtarma17. Bunlar arasında, yerinde Hi-C 3C ligasyon ürünleri genom çapında18dizileme sağlayan popüler bir teknik haline gelmiştir. Ancak, arttırıcı-organizatör kontaklarının analizine uygun bir çözüme ulaşmak için gereken yüksek sıralama maliyetleri, bu tekniği belirli lokusların incelenmesi için pratik hale getirir. Bu nedenle, alternatif yöntemler yüksek çözünürlükte hedeflenen loci analiz etmek için geliştirilmiştir19,20,21,22. Bu yöntemlerden biri, yani 4C, tüm strateji karşı bir olarak bilinen, bakış açısı olarak seçilen bir site temas tüm dizileri algılama sağlar. Ancak, standart 4C tekniğinin bir dezavantajı ters PCR gerekli, hangi farklı boyutlarda parçaları güçlendirir, küçük ürünler lehine ve yüksek iş lenme sıralaması sonra sayısal önyargı. Son zamanlarda, UMI-4C, benzersiz moleküler tanımlayıcılar (UMI) kullanarak 4C tekniğinin yeni bir varyantı bu sorunu 23 atlatan kantitatif ve hedefli kromozomkontumasyon profilleme için geliştirilmiştir23. Bu yaklaşım, sık sık kesiciler, sonication ve iç içe ligasyon aracılı PCR protokolü kullanır, böylece nispeten düzgün uzunluk dağılımı ile DNA parçalarının amplifikasyon içeren. Bu homojenlik, PCR tercihlerinin daha kısa diziler için amplifikasyon sürecindeki önyargıları azaltır ve uzamsal bağlı moleküllerin/parçaların verimli bir şekilde kurtarılmasını ve doğru sayılmasına olanak tanır.
Burada, EB farklılaşması sırasında soyu öğretici transkripsiyon faktörlerinin organizatörleri ve arttırıcıları arasındaki kromatin temaslarını tanımlamak ve ölçmek için UMI-4C tekniğini uyarlayan bir protokolü açıklıyoruz.
Asılı damla kültür yöntemi ek büyüme faktörleri veya sitokinler gerekmez ve tekrartekrar mESCs5önceden belirlenmiş sayıda EBs homojen popülasyonları oluşturur . Burada, EB farklılaştırma modelinde soya özgü transkripsiyon faktörlerinin arttırıcı-organizatör temasının ölçülebilir hale getirmek için UMI-4C yaklaşımından uyarlanmış nicel 4C protokolünü açıklıyoruz. EB farklılaşması sırasında Pou5f1 ve T genlerinin organizatörleri ile dinamik bir şekilde temas eden kromatin bölgelerini belirledik. Pou5f1, EB farklılaşması sırasında bozuldu ve Pou5f1 organizatörü ile distal arttırıcısı arasındaki temas frekansı azaldı. Tersine, EB farklılaşması sırasında T düzenlendi ve organizatörü ile temas frekanslarının azaldığı üç arttırıcı belirledik(Şekil 3). Kimlik doğrulamak için, aktif histon işareti H3K27ac bir kromatin immünopresipitasyon (ChIP) tsayyapılabilir 24, Bu histon işareti arttırıcı aktivasyon ile ilişkili olduğu gösterilmiştir ve arttırıcılar onların inaktivasyon sırasında bu işareti kaybedersiniz11.
Standart bir 4C tekniği, spesifik genomik alanların kromatin temas profilini incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır25. Ancak, pcr parça boyutunun heterojenliği ve PCR kopyalarını ayırt etme imkânının getirdiği önyargılar nedeniyle, kapsamlı normalleştirme26,27,28’den sonra bile bu yaklaşımı nicel olarak yorumlamak zordur. Bizim kantitatif 4C yöntemi büyük ölçüde sonication ve bir iç içe-ligasyon aracılı PCR adım kullanarak tek moleküllerin sayısallaştırılması sağlayan UMI-4C tekniği ile aynıdır klasik 4C yaklaşım23sınırlama atlamak için . Ancak, benzersiz moleküler tanımlayıcılar kullanan UMI-4C’nin aksine, kantitatif 4C protokolümüz sonication step tarafından üretilen spesifik DNA kırılmasına göre tek moleküllerin sayısallaştırılmasına olanak sağlar. Protokolümüzü ticari DNA kitaplığı hazırlama kitleri ile uyumlu hale getirerek, eşsiz moleküler tanımlayıcılarla astar ihtiyacını ortadan kılmaktadır.
Protokolümüz göz önünde bulundurulması gereken birkaç önemli adımı içerir. Klasik 4C yöntemi28’deolduğu gibi, protokolümüzün kritik faktörleri 3C moleküllerinin hazırlanması sırasında sindirim in verimliliği ve ligasyondur. Düşük sindirim/ligasyon verimliliği, ilgi nin bir parçasıyla etkileşimin karmaşıklığını önemli ölçüde azaltabilir ve bu da çözünürlüğün azalmasına neden olabilir. Daha önce açıklandığı gibi23, protokolün bir başka kritik adım kütüphane amplifikasyon için astar tasarımıdır. İkinci PCR reaksiyon astarları sorgulanan kısıtlama sitesinden 5-15 nt bulunmalıdır. 75 nt sıralama okumasında, bu eşleme için yakalama uzunluğunun en az 40 nt soluna izin verir. İlk PCR reaksiyonunda kullanılan astar, üst üste çakışma olmadan ikinci astarın yukarısına tasarlanmalı ve her ikisi de verimli DNA amplifikasyonu sağlayacak kadar spesifik olmalıdır. Çoklama için astarlar 60-65 °C’lik bir erime sıcaklığı (Tm)hedefleyen bağımsız olarak tasarlanmalıdır. Ayrıca, diğer 3C tekniklerinde olduğu gibi, kantitatif 4C yönteminin çözünürlüğü protokol25’tekullanılan restriksiyon enzimi ile belirlenir. Bu protokol, 4 bp tanıma bölgesi olan MboI’lı bir restriksiyon enzimi kullanır. Bu enzim ile maksimum çözünürlük yaklaşık 500 bp, ama bu son derece lokus bağımlı ve nadiren elde edilir. Başka bir sınırlama, aynı kısıtlama parçasında bulunan öğeler arasında oluşan etkileşimlerin algılanmamasıdır. Buna ek olarak, bir kısıtlama alanının uzaklığında meydana gelen etkileşimler sindirilmemiş arka plandan ayırt edilemez. Ligasyondan önce doldurma adımı nın kullanılması, bu etkileşimlerin algılanmasına izin verebilir.
Kantitatif 4C, hedeflenen lokusun kromatin kontalarını sorgulamak için idealdir. Ancak, belirli PCR amplifikasyon adımı aynı anda araştırılabilir loci sayısını sınırlar. Hedeflenen loci sayısını artırmanın bir yolu, aynı anda birden fazla hedefi yükseltmek için PCR adımlarını çok katlı yapmaktır, ancak bu, kullanılan astarların uyumluluğunu ve uygulamadan önce her astar çiftinin test edilmesini gerektirir. Organizatörlerde kromatin mimarisinin küresel değişiklikler istenirse, Hi-C, PC Hi-C veya HiChIP gibi genom çapında yaklaşımlar daha uygun olacaktır29,30,31.
The authors have nothing to disclose.
F. Le Dily, R. Stadhouders ve Graf laboratuvarı üyelerine tavsiye ve tartışmaları için teşekkür ederiz. G.S., Marie Sklodowska-Curie bursu (H2020-MSCA-IF-2016, miRStem), T.V.T. tarafından Juan de la Cierva doktora sonrası bursu (MINECO, FJCI-2014-22946) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma, Avrupa Araştırma Konseyi tarafından7.Çerçeve Programı FP7 (ERC Sinerji Grant 4D-Genome, 609989 to T.G., İspanya Ekonomi, Sanayi ve Rekabet Bakanlığı (MEIC) kapsamında EMBL ortaklığı, Centro de Excelencia Severo Ochoa 2013-2017 ve CERCA Programı Generalitat de Catalun kapsamında desteklenmiştir.
0.1% EmbryoMax gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | Cell culture |
0.25% Trypsin-EDTA | 25200072 | ||
AMPure XP | Beckman Coulter | 10136224 | 4C/DNA purification |
B27 supplement | Gibco | 17504044 | Cell culture |
Beta-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | Cell culture |
Bioruptor Pico | Diagencode | B01060010 | 4C/sonication |
BSA | NEB | B9000S | 4C |
CHIR99021 | Selleck Chemicals | S1263 | Cell culture |
CIP | NEB | M0212 | 4C |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | 4C |
DMEM/F12 medium | Gibco | 11320033 | Cell culture |
dNTP | NEB | N0447S | 4C |
ESGRO Leukaemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1107 | Cell culture |
Formaldehyde solution (37%) | Sigma | 252549-25ML | 4C |
Glycin | Sigma | GE17-1323-01 | 4C |
Glycogen | ThermoFischer | R0551 | 4C |
Herculase II Fusion DNA polymerase | Agilent | 600675 | 4C |
IGEPAL CA-630 | Sigma | I3021-50ML | 4C |
Knockout DMEM | 10829018 | ||
L-glutamine | Gibco | 25030081 | Cell culture |
MboI | NEB | R0147M | 4C |
MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | Cell culture |
N2 supplement | Gibco | A1370701 | Cell culture |
NEBNext DNA Library prep | NEB | E6040 | 4C |
NEBuffer 2.1 | NEB | B7202S | 4C/digestion |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Cell culture |
PD0325901 | Selleck Chemicals | S1036 | Cell culture |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
Proteinase K | NEB | P8107S | 4C |
Qubit 4 Fluorometer | ThermoFischer | Q33238 | 4C |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFischer | Q32851 | 4C |
RNase A | ThermoFischer | EN0531 | 4C |
Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360070 | Cell culture |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Cell culture |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | 4C |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | M0202M | 4C |