تحديد جهات اتصال محسن-المروج في الأجسام الجنينية من خلال التقاط تثبيت الكروموسومات الكمية (4C)
Summary
نبلغ عن تطبيق التقاط توسوم كموئي متبوع بتسلسل عالي الإنتاجية في أجسام جنينية متولدة من خلايا جذعية جنينية. تسمح هذه التقنية بتحديد وكمية الاتصالات بين المحسّنين المفترضين ومناطق المروج لجين معين أثناء تمايز الخلايا الجذعية الجنينية.
Abstract
خلال تطور الثدييات، يتم تحديد مصائر الخلايا من خلال إنشاء شبكات تنظيمية تحدد خصوصية التعبير الجيني وتوقيته وأنماطه المكانية. كانت الأجسام الجنينية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات نموذجًا شائعًا لدراسة التمايز بين الطبقات الجرثومية الثلاث الرئيسية وتحديد الدوائر التنظيمية أثناء مواصفات مصير الخلايا. على الرغم من أنه من المعروف أن القدرة الخاصة بالأنسجة تلعب دورا هاما في هذه الشبكات من خلال التفاعل مع المروجين، وتعيينها إلى الجينات المستهدفة ذات الصلة لا يزال يشكل تحديا. ولجعل ذلك ممكناً، هناك حاجة إلى نُهج كمية لدراسة الاتصالات بين المروِّجيين ودينامياتهم أثناء التنمية. هنا ، قمنا بتكييف طريقة 4C لتعريف المحسّنات واتصالاتها مع مروجي cognate في نموذج التمايز EB. تستخدم هذه الطريقة قطع إنزيمات التقييد وسونيكيشن وبروتوكول PCR متداخل التطفل المتوافق مع مجموعات إعداد مكتبة الحمض النووي التجارية. وفي وقت لاحق، تخضع مكتبات 4C لتسلسل عالي الإنتاجية ويتم تحليلها من الناحية المعلوماتية الحيوية، مما يسمح بالكشف عن جميع التسلسلات التي لها اتصالات مع مروج مختار وتقديرها كمياً. ويمكن أيضا استخدام بيانات التسلسل الناتجة للحصول على معلومات عن ديناميات جهات الاتصال المحسن ة المروجة أثناء التمايز. من السهل تنفيذ التقنية الموصوفة لنموذج التمايز EB.
Introduction
في الفئران، تحتوي كتلة الخلايا الداخلية (ICM) للأجنة التي يبلغ عمرها 3.5 يوم على خلايا جذعية جنينية متعددة القدرات. يتطور ICM إلى epiblast في اليوم 4.5 ، مما يولد ectoderm ، mesoderm ، وخلايا endoderm ، وهي الطبقات الرئيسية الثلاث الجرثومية في الجنين. على الرغم من أن الخلايا متعددة القدرات في ICM موجودة فقط بشكل عابر في الجسم الحي ، يمكن التقاطها في الثقافة عن طريق إنشاء الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (mESCs)1،2،3. تبقى mESCs في حالة غير متمايزة وتتكاثر إلى أجل غير مسمى ، ولكن على المحفزات الجوهرية والخارجية فهي قادرة أيضًا على الخروج من حالة القدرة المتعددة وتوليد خلايا الطبقات الجرثومية التنموية الثلاث2،4. ومن المثير للاهتمام، عندما مثقف في التعليق في قطرات صغيرة، mESCs تشكل مجاميع ثلاثية الأبعاد (أي EBs) التي تميز في جميع الطبقات الجرثومية الثلاث5. يعد وصف تشكيل EB أداة مهمة لدراسة عملية مواصفات النسب المبكرة.
أثناء مواصفات النسب، تحصل خلايا كل طبقة جرثومية على برنامج تعبير جيني محدد4. يتم تنظيم التعبير الزمني الدقيق للجينات من قبل العناصر التنظيمية المتنوعة لرابطة الدول المستقلة ، بما في ذلك المروجين الأساسيين ، والمحسنين ، وكواتم الصوت ، والعوازل6،7،8،9. محسنات، قطاعات الحمض النووي التنظيمية التي تمتد عادة بضع مئات من أزواج قاعدة، وتنسيق التعبير الجيني خاصة بالأنسجة8. يتم تنشيط المحسّنات أو إسكاتها عن طريق ربط عوامل النسخ والعوامل المساعدة التي تنظم بنية الكروماتين المحلية8،10. التقنيات الشائعة الاستخدام لتحديد المحسّنات المفترضة هي ترسيب مناعة الكروماتين على نطاق الجينوم يليه التسلسل (ChIP-seq) والقول لتقنيات الكروماتين التي يمكن الوصول إليها عبر الترانسبوماز باستخدام التسلسل (ATAC-seq). وهكذا، تتميز المحسّنات النشطة بعلامات هيستون نشطة محددة وبزيادة إمكانية الوصول إلى الحمض النووي المحلي11،12،13،14. وبالإضافة إلى ذلك، ويعتقد أن القدرة التنموية تتطلب التفاعل المادي مع المروج cognate8،9. في الواقع، فقد ثبت أن المتغيرات محسن والحذف التي تعطل الاتصالات محسن المروج يمكن أن يؤدي إلى تشوهاتالتنموية 15. لذلك ، هناك حاجة إلى تقنيات جديدة توفر معلومات إضافية لتحديد المحسّنين الوظيفيين الذين يتحكمون في التعبير الجيني التنموي.
منذ تطوير ضبط التّصيّاق الكروموسومي (3C) تقنية16، تم استخدام رسم خرائط المخالطين الكروموسومي بشكل مكثف لتقييم المسافة الفيزيائية بين العناصر التنظيمية. الأهم من ذلك، تم مؤخرا تطوير المتغيرات عالية الإنتاجية من تقنيات 3C، وتوفير استراتيجيات مختلفة لتثبيت، والهضم، والربط، واستعادة الاتصالات بين شظايا الكروماتين17. من بينها، في الموقع مرحبا- C أصبحت تقنية شعبية تسمح لتسلسل 3C ربط المنتجات الجينوم واسعة18. ومع ذلك ، فإن تكاليف التسلسل العالية المطلوبة للتوصل إلى حل مناسب لتحليل جهات الاتصال المحسنة المروجة يجعل هذه التقنية غير عملية لدراسة loci محددة. لذلك ، تم تطوير طرق بديلة لتحليل loci المستهدفة في قرار أعلى19،20،21،22. واحدة من هذه الطرق ، وهي 4C ، والمعروفة باسم واحد مقابل استراتيجية للجميع ، ويسمح الكشف عن جميع التسلسلات التي تتصل موقع مختارة كوجهة نظر. ومع ذلك ، فإن عيب تقنية 4C القياسية هو PCR المعكوس المطلوب ، والذي يضخم شظايا مختلفة الحجم ، وتفضل المنتجات الصغيرة والتقدير الكمي المتحيز بعد التسلسل عالي الإنتاجية. في الآونة الأخيرة، UMI-4C، تم تطوير متغير جديد من تقنية 4C باستخدام معرفات جزيئية فريدة من نوعها (UMI) لتنميط الاتصال الكروموسومي الكمي والمستهدف الذي يتحايل على هذه المشكلة23. ويستخدم هذا النهج القواطع المتكررة، وسونيكيشن، وبروتوكول PCR متداخل ة الربط بوساطة، مما ينطوي على تضخيم شظايا الحمض النووي مع توزيع طول موحد نسبيا. ويقلل هذا التجانس من التحيزات في عملية تضخيم تفضيلات PCR للتسلسلات الأقصر ويسمح بالاسترداد الفعال والعد الدقيق للجزيئات/الشظايا المتصلة مكانياً.
هنا نحن وصف بروتوكول الذي يكيف تقنية UMI-4C لتحديد وتحديد الاتصالات الكروماتين بين المروجين ومحسنات عوامل النسخ المفيدة النسب خلال التمايز EB.
Protocol
Representative Results
Discussion
لا تحتاج طريقة ثقافة الإفلات المعلق إلى عوامل نمو إضافية أو السيتوكينات وتولد بشكل مستنسخ مجموعات متجانسة من EBs من عدد محدد مسبقًا من mESCs5. هنا نصف بروتوكول من 4C الكمية تكييفها من نهج UMI-4C لتحديد الاتصال محسن المروج من عوامل النسخ المحددة النسب في نموذج التمايز EB. حددنا مناطق الكروماتين التي تتصل بمروجي جينات Pou5f1 و T بطريقة ديناميكية خلال تمايز EB. تم downregulationed Pou5f1 خلال تمايز EB وتناقص تردد الاتصال بين المروج Pou5f1 ومحسن ه distal. وعلى العكس من ذلك، تم رفع T خلال تمايز EB وحددنا ثلاثة محسنات يتم تقليل ترددات الاتصال مع مروجها(الشكل 3). لتأكيد تحديد الهوية، يمكن إجراء فحص الترسيب المناعي اللوني (ChIP) من علامة الهستون النشطة H3K27ac24، حيث ثبت أن هذه العلامة الهستون مرتبطة بتنشيط محسن والقدرة تفقد هذه العلامة أثناء تعطيلها11.
وقد استخدمت تقنية قياسية 4C على نطاق واسع لمسح ملف الاتصال الكروماتين لمواقع الجينوم محددة25. غير أن هذا النهج يصعب تفسيره كمياً حتى بعد التطبيع الواسع النطاق26و27,,و28 بسبب التحيزات التي أدخلها عدم تجانس حجم تجزؤ الـ PCR واستحالة التمييز بين تكرارات PCR. لدينا طريقة 4C الكمية متطابقة إلى حد كبير إلى تقنية UMI-4C التي تسمح بالقياس الكمي للجزيئات الفردية باستخدام سونيكيشن وخطوة PCR بوساطة الربط المتداخلة لتجاوز الحد من نهج 4C الكلاسيكي23. ومع ذلك ، على عكس UMI-4C التي تستخدم معرفات جزيئية فريدة من نوعها ، يسمح بروتوكول4C الكمي لدينا بالقياس الكمي للجزيئات المفردة استنادًا إلى كسر الحمض النووي المحدد الذي تنتجه خطوة سونيكيشن. يجعل بروتوكولنا متوافقًا مع مجموعات إعداد مكتبة الحمض النووي التجارية ، مما يغني عن الحاجة إلى الالتمهيديات ذات المعرفات الجزيئية الفريدة.
يتضمن بروتوكولنا عدة خطوات رئيسية ينبغي النظر فيها. كما هو الحال في الطريقة الكلاسيكية 4C28، والعوامل الحاسمة لبروتوكولنا هي كفاءة الهضم والربط أثناء إعداد جزيئات 3C. انخفاض كفاءة الهضم / الربط يمكن أن تقلل بشكل كبير من تعقيد التفاعل مع جزء من الاهتمام ، مما يؤدي إلى انخفاض الدقة. كما وصف سابقا23، خطوة أخرى حاسمة من البروتوكول هو تصميم التمهيديات لتضخيم المكتبة. وينبغي أن يكون موقع التمهيديات رد فعل PCR الثاني 5-15 nt من موقع التقييد استجواب. في قراءة تسلسل 75 NT، يسمح هذا لما لا يقل عن 40 nt اليسار من طول الالتقاط لتعيين. وينبغي تصميم التمهيدي المستخدم في رد الفعل الأول لتفاعل تفاعل الـ PCR في المنبع من التمهيدي الثاني دون أي تداخل، وينبغي أن يكون كلاهما محددًا بما يكفي لضمان تضخيم الحمض النووي الفعال. لmultixing، يجب تصميم التمهيديات بشكل مستقل، تهدف إلى درجة حرارة ذوبان (Tم)من 60-65 درجة مئوية. وعلاوة على ذلك، أما بالنسبة لتقنيات 3C الأخرى، يتم تحديد دقة الطريقة 4C الكمية من قبل إنزيم تقييد المستخدمة في البروتوكول25. يستخدم هذا البروتوكول إنزيم تقييد مع موقع التعرف على 4 bp، MboI. الحد الأقصى للقرار مع هذا الانزيم حوالي 500 bp، ولكن هذا هو مركز تعتمد للغاية ونادرا ما يتحقق. تقييد آخر هو أن التفاعلات التي تحدث بين العناصر الموجودة في جزء القيد نفسه غير قابلة للكشف. بالإضافة إلى ذلك، لا يمكن تمييز التفاعلات التي تحدث على مسافة موقع تقييد واحد عن الخلفية غير المهضومة. قد يسمح استخدام خطوة تعبئة قبل الربط بالكشف عن هذه التفاعلات.
الكمية 4C هو مناسبة بشكل مثالي لاستجواب المخالطين الاتصالات من loci المستهدفة. ومع ذلك، فإن خطوة تضخيم PCR المحددة تحد من عدد loci التي يمكن التحقيق فيها في وقت واحد. وهناك طريقة لزيادة عدد loci المستهدفة هو متعدد الخطوات PCR لتضخيم العديد من الأهداف في وقت واحد، ولكن هذا يتطلب التوافق من التمهيديات المستخدمة واختبار كل زوج التمهيدي قبل التنفيذ. إذا كانت التغييرات العالمية في العمارة الكروماتين في المروجين مرغوبة ، فإن النهج على نطاق الجينوم مثل Hi-C أو PC Hi-C أو HiChIP سيكون أكثر ملاءمة29،30،31.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر ف. لو ديلي، ور. ستادهودرس، وأعضاء مختبر غراف على نصائحهم ومناقشاتهم. تم دعم G.S. من قبل زمالة ماري سكلودوسكا كوري (H2020-MSCA-IF-2016، miRStem)، T.V.T من قبل زمالة خوان دي لا سيرفا ما بعد الدكتوراه (MINECO، FJCI-2014-22946). وقد دعم هذا العمل مجلس البحوث الأوروبي في إطار البرنامج الإطاريالسابع FP7 (ERC Synergy Grant 4D-Genome، اتفاقية المنح 609989 إلى T.G.)، ووزارة الاقتصاد والصناعة والقدرة التنافسية الإسبانية (MEIC) إلى شراكة EMBL، Centro de Excelencia Severo Ochoa 2013-2017 وبرنامج CERCA Generalitat de Catalunya.
Materials
| 0.1% EmbryoMax gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | Cell culture |
| 0.25% Trypsin-EDTA | 25200072 | ||
| AMPure XP | Beckman Coulter | 10136224 | 4C/DNA purification |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | Cell culture |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | Cell culture |
| Bioruptor Pico | Diagencode | B01060010 | 4C/sonication |
| BSA | NEB | B9000S | 4C |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S1263 | Cell culture |
| CIP | NEB | M0212 | 4C |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | 4C |
| DMEM/F12 medium | Gibco | 11320033 | Cell culture |
| dNTP | NEB | N0447S | 4C |
| ESGRO Leukaemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1107 | Cell culture |
| Formaldehyde solution (37%) | Sigma | 252549-25ML | 4C |
| Glycin | Sigma | GE17-1323-01 | 4C |
| Glycogen | ThermoFischer | R0551 | 4C |
| Herculase II Fusion DNA polymerase | Agilent | 600675 | 4C |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I3021-50ML | 4C |
| Knockout DMEM | 10829018 | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | Cell culture |
| MboI | NEB | R0147M | 4C |
| MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | Cell culture |
| N2 supplement | Gibco | A1370701 | Cell culture |
| NEBNext DNA Library prep | NEB | E6040 | 4C |
| NEBuffer 2.1 | NEB | B7202S | 4C/digestion |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Cell culture |
| PD0325901 | Selleck Chemicals | S1036 | Cell culture |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Proteinase K | NEB | P8107S | 4C |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFischer | Q33238 | 4C |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFischer | Q32851 | 4C |
| RNase A | ThermoFischer | EN0531 | 4C |
| Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360070 | Cell culture |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Cell culture |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | 4C |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | M0202M | 4C |
References
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
- Martello, G., Smith, A. The nature of embryonic stem cells. Annual Review Cell and Developmental Biology. 30, 647-675 (2014).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Loh, K. M., Lim, B., Ang, L. T. Ex uno plures: molecular designs for embryonic pluripotency. Physiological Reviews. 95 (1), 245-295 (2015).
- Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency. Stem Cells International. 2012, 738910 (2012).
- Gaszner, M., Felsenfeld, G. Insulators: exploiting transcriptional and epigenetic mechanisms. Nature Reviews in Genetics. 7 (9), 703-713 (2006).
- Lenhard, B., Sandelin, A., Carninci, P. Metazoan promoters: emerging characteristics and insights into transcriptional regulation. Nature Reviews in Genetics. 13 (4), 233-245 (2012).
- Long, H. K., Prescott, S. L., Wysocka, J. Ever-Changing Landscapes: Transcriptional Enhancers in Development and Evolution. Cell. 167 (5), 1170-1187 (2016).
- Schoenfelder, S., Fraser, P. Long-range enhancer-promoter contacts in gene expression control. Nature Reviews in Genetics. 20 (8), 437-455 (2019).
- Spitz, F., Furlong, E. E. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nature Reviews in Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews in Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
- Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
- Lettice, L. A., et al. Development of five digits is controlled by a bipartite long-range cis-regulator. Development. 141 (8), 1715-1725 (2014).
- Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
- de Wit, E., de Laat, W. A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization. Genes and Development. 26 (1), 11-24 (2012).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
- Simonis, M., et al. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C). Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).
- Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: from fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
- Stadhouders, R., et al. Multiplexed chromosome conformation capture sequencing for rapid genome-scale high-resolution detection of long-range chromatin interactions. Nature Protocols. 8 (3), 509-524 (2013).
- van de Werken, H. J., et al. Robust 4C-seq data analysis to screen for regulatory DNA interactions. Nature Methods. 9 (10), 969-972 (2012).
- Schwartzman, O., et al. UMI-4C for quantitative and targeted chromosomal contact profiling. Nature Methods. 13 (8), 685-691 (2016).
- Tian, T. V., et al. Whsc1 links pluripotency exit with mesendoderm specification. Nature Cell Biology. 21 (7), 824-834 (2019).
- Chen, H., et al. Dynamic interplay between enhancer-promoter topology and gene activity. Nature Genetics. 50 (9), 1296-1303 (2018).
- Apostolou, E., et al. Genome-wide chromatin interactions of the Nanog locus in pluripotency, differentiation, and reprogramming. Cell Stem Cell. 12 (6), 699-712 (2013).
- de Wit, E., et al. The pluripotent genome in three dimensions is shaped around pluripotency factors. Nature. 501 (7466), 227-231 (2013).
- Krijger, P. H. L., Geeven, G., Bianchi, V., Hilvering, C. R. E., de Laat, W. 4C-seq from beginning to end: A detailed protocol for sample preparation and data analysis. Methods. , (2019).
- Mumbach, M. R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).
- Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
- Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
