Generazione di Oligodendrociti e Mezzo Condizionato oligodendrocito per Esperimenti Co-Culture
Summary
Qui, esponiamo un metodo efficiente per la purificazione degli oligodendrociti e la produzione di mezzo con condizioni oligodendrocite che possono essere utilizzati per esperimenti di co-cultura.
Abstract
Nel sistema nervoso centrale, gli oligodendrociti sono ben noti per il loro ruolo nella mielinazione degli assoni, che accelera la propagazione dei potenziali d’azione attraverso la conduzione saltatoria. Inoltre, un numero crescente di rapporti suggeriscono che gli oligodendrociti interagiscono con neuroni oltre la mielinazione, in particolare attraverso la secrezione di fattori solubili. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che consente la purificazione delle cellule di lignaggio oligodolole da colture cellulari gliali contenenti anche astrociti e cellule microgliali. Il metodo si basa sull’agitazione notturna a 37 gradi centigradi, che consente il distacco selettivo delle cellule oliedendrogliali sovrastanti e delle cellule microgliali e l’eliminazione della microglia mediante adesione differenziale. Descriviamo quindi la cultura degli oligodendrociti e la produzione di mezzi condizionati con oligodendrociti (OCM). Forniamo anche la cinetica del trattamento OCM o oligodendrociti aggiunta ai neuroni ippocampali purificati in esperimenti di co-cultura, studiando le interazioni oligodendrocite-neurone.
Introduction
Gli oligodendrociti (OL) sono cellule gliali del sistema nervoso centrale (SNC) che generano mielina avvolgendo gli assoni. Gli OL provengono da cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) che proliferano all’interno delle zone ventricolari del SNC embrionale e poi migrano e si differenziano in OL completamente maturi (cioè cellule formanti mielina)1. Gli OPC sono abbondanti durante lo sviluppo precoce, ma persistono anche nel cervello adulto dove rappresentano la principale popolazione di cellule proliferanti2. Un singolo OL racchiude più assoni multipli in sezioni non eccitabili (ad esempio, internodi) e il bordo di ogni anello mielina si attacca all’assone formando il dominio paranodale che è cruciale per le proprietà isolanti della mielina1,3. Tra i paranodi ci sono piccole lacune non mielinated chiamate nodi di Ranvier. Questi nodi sono ricchi di canali di sodio legati alla tensione (Nav), permettendo la rigenerazione e la rapida propagazione dei potenziali d’azione attraverso la conduzione saltatoria4. Questa interazione stretta consente anche il supporto energetico assonale attraverso l’assorbimento neuronale di lattato da OLs5,6.
La maturazione delle cellule di lignaggio oligodendrogliale e il processo di mielinazione sono strettamente regolati dalle loro interazioni con i neuroni7. Infatti, OL e OPC, chiamati anche cellule NG2, esprimono una serie di recettori per i neurotrasmettitori, e possono ricevere input da neuroni eccitatori e inibitori, permettendo loro di percepire l’attività neuronale che può innescare la loro proliferazione e/o differenziazione nelle cellule mielinanti2. A sua volta, gli OPC/OL secernono microvescicoli e proteine nello spazio extracellulare che da solo o sinergicamente mediano le funzioni neuromodative e neuroprotettive8,9,10,11,12. Tuttavia, i meccanismi molecolari che controllano le molteplici modalità di interazione tra cellule lignee e neuroni oligodendrocliali devono ancora essere completamente decifrati.
Inoltre, in diverse condizioni patologiche del SNC, gli OL sono principalmente colpiti, disturbando così la loro interazione con i neuroni. Ad esempio, nella sclerosi multipla (MS), la disfunzione neurologica è causata dalla demielinazione focale nel SNC, secondaria alla perdita di OLs che può portare a danni assonali e relativo accumulo di disabilità. La remielinazione può avvenire, anche se in misura insufficiente nella maggior parte dei casi13. I progressi compiuti nell’ultimo decennio, dovuti allo sviluppo di immunoterapie, hanno ridotto il tasso di ricaduta, ma la promozione della remielinazione rimane fino ad oggi un bisogno insoddisfatto. Come tale, una migliore comprensione del ruolo, delle funzioni e delle influenze di OLs è di particolare interesse per lo sviluppo di nuove terapie per un ampio spettro di condizioni del SNC.
Qui, descriviamo i metodi di purificazione e cultura oLs. Ciò consente un esame preciso dei meccanismi intrinseci che regolano il loro sviluppo e la biologia. Inoltre, tali colture OLaltamente arricchite permettono la produzione di un mezzo condizionato dagli oligodendrociti (OCM), che può essere aggiunto alle colture neuronali purificate per ottenere informazioni sull’impatto dei fattori secreti di OL sulla fisiologia e la connettività neuronali. Inoltre, descriviamo come implementare un sistema di cocoltura in vitro in cui gli oligodendrociti purificati e i neuroni sono combinati insieme, permettendo di affrontare i meccanismi che regolano (rielinazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, forniamo un protocollo dettagliato per ottenere impostazioni cellulari l’oligodendrogliale altamente arricchite da colture gliali miste, adattate da un metodo pubblicato in precedenza16,e la successiva produzione di mezzo condizionato da OL. Questa tecnica di agitazione non è costosa, può essere ripetuta tre volte ed è ottimale per ottenere un’elevata quantità di OL purificati, come le cellule coltivate in Bottenstein-Sato (BS) proliferano PDGF. Le cellule gliali sono preparate utilizzand…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Rémi Ronzano per i suoi saggi consigli nel montaggio di manoscritti. Questo lavoro è stato finanziato da ICM, INSERM, sovvenzione della fondazione ARSEP per NSF e Bouvet-Labruyère price.
Materials
| 5-fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221-M | |
| Ethanol 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Fetal Calf Serum | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cysteine | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polyethylenimine(PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborate decahydrate | Sigma | B9876 | |
| Trypsin | Sigma | Sigma | |
| Uridine | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| T4 (L-Thyroxine) | Sigma | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| Recombinant Human CNTF | Sigma | 450-13 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm filter | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL syringe | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Petri dish | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL tube | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL tube | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm Petri dish | Dutscher | 067003 | |
| 70 µm filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Binocular microscope | Olympus | SZX7 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Scalpel | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Small surgical spoon | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 flask with filter cap | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
References
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