Generación de oligodendrocitos y medio condicionado por oligodendrocitos para experimentos de cocultura
Summary
En este documento, mostramos un método eficiente para la purificación de oligodendrocitos y la producción de medio condicionado por oligodendrocitos que se puede utilizar para experimentos de cocultivo.
Abstract
En el sistema nervioso central, los oligodendrocitos son bien conocidos por su papel en la mielinización de axón, que acelera la propagación de potenciales de acción a través de la conducción saltatoria. Por otra parte, un número creciente de informes sugieren que los oligodendrocitos interactúan con las neuronas más allá de la mielinización, en particular a través de la secreción de factores solubles. Aquí, presentamos un protocolo detallado que permite la purificación de células de linaje oligodendroglial de cultivos celulares gliales que también contienen astrocitos y células microgliales. El método se basa en el temblor nocturno a 37 oC, que permite el desprendimiento selectivo de las células oligodendrogliales y microglia superpuestas, y la eliminación de la microglia por adhesión diferencial. A continuación, describimos el cultivo de oligodendrocitos y la producción de medio condicionado por oligodendrocitos (OCM). También proporcionamos la cinética del tratamiento OCM u oligodendrocitos adición a las neuronas hipocampales purificadas en experimentos de cocultivo, estudiando interacciones oligodendrocitos-neuronas.
Introduction
Los oligodendrocitos (OL) son células gliales del sistema nervioso central (SNC) que generan envoltura de mielina alrededor de los axones. Los OL s originan a partir de células precursoras de oligodendrocitos (OPO) que proliferan dentro de las zonas ventriculares del SNC embrionario y luego migran y diferencian en OLs completamente maduras (es decir, células formadoras de mielina)1. Los OPO son abundantes durante el desarrollo temprano, pero también persisten en el cerebro adulto donde representan la mayor población celular proliferativa2. Un solo OL envuelve múltiples axones en secciones no excitables (es decir, internodos), y el borde de cada bucle de mielina se une al axón formando el dominio paranodal que es crucial para las propiedades aislantes de la mielina1,3. Entre los paranodos hay pequeños huecos no mielinizados llamados los nodos de Ranvier. Estos nodos son ricos en canales de sodio (Nav) cerrados por voltaje, lo que permite la regeneración y rápida propagación de potenciales de acción a través de la conducción saltatoria4. Esta estrecha interacción también permite el apoyo de la energía axonal a través de la toma neuronal de lactato de OLs5,6.
La maduración de las células de linaje oligodendroglial y el proceso de mielinización están estrechamente regulados por sus interacciones con las neuronas7. De hecho, los OL y los OPO, también llamados células NG2, expresan una serie de receptores de neurotransmisores, y pueden recibir información de las neuronas excitatorias e inhibitorias, lo que les permite sentir la actividad neuronal que puede desencadenar su proliferación y / o diferenciación en las células mielinizadoras2. A su vez, los OPO/OLs secretan microvesículas y proteínas en el espacio extracelular que solo o sinérgicamente median las funciones neuromoduladoras y neuroprotectoras8,9,10,11,12. Sin embargo, los mecanismos moleculares que controlan los múltiples modos de interacciones entre las células de linaje oligodendroglial y las neuronas aún no se han descifrado completamente.
Por otra parte, en varias condiciones patológicas del SNC, los OLs se ven afectados principalmente, lo que perturba su interacción con las neuronas. Por ejemplo, en la Esclerosis Múltiple (EP), la disfunción neurológica es causada por la desmielinización focal en el SNC, secundaria a la pérdida de OLs que puede conducir a daño axonal y acumulación de discapacidad relacionada. La remielinización puede tener lugar, aunque insuficientemente en la mayoría de los casos13. Los progresos en la última década, debido al desarrollo de inmunoterapias, han reducido la tasa de recaídas, pero la promoción de la remielinización sigue siendo hasta la fecha una necesidad insatisfecha. Como tal, una mejor comprensión del papel, las funciones y las influencias de los ostales es de particular interés para el desarrollo de nuevas terapias para un amplio espectro de condiciones del SNC.
Aquí, describimos los métodos de purificación y cultivo de OLs. Esto permite un examen preciso de los mecanismos intrínsecos que regulan su desarrollo y biología. Además, estos cultivos de OLs altamente enriquecidos permiten la producción de medio condicionado por oligodendrocitos (OCM), que se puede agregar a los cultivos de neuronas purificadas para obtener información sobre el impacto de los factores secretos por OLs en la fisiología neuronal y la conectividad. Además, describimos cómo implementar un sistema de cocultivo in vitro donde se combinan oligodendrocitos y neuronas purificados, lo que permite abordar los mecanismos que regulan (re)mielinización.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para obtener cultivos celulares de linaje oligodendroglial altamente enriquecidos a partir de cultivos glialmixtos, adaptados a partir de un método publicado previamente16,y la posterior producción de medio condicionado por OL. Esta técnica de agitación no es costosa, se puede repetir tres veces y es óptima para obtener una gran cantidad de obsturas purificadas, ya que proliferan las células cultivadas en el medio Bottenstein-Sato (BS) que contien…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores quieren agradecer a Rémi Ronzano por su sabio consejo en la edición de manuscritos. Este trabajo fue financiado por iCM, INSERM, la fundación ARSEP a NSF, y el precio Bouvet-Labruyére.
Materials
| 5-fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221-M | |
| Ethanol 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Fetal Calf Serum | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cysteine | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polyethylenimine(PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborate decahydrate | Sigma | B9876 | |
| Trypsin | Sigma | Sigma | |
| Uridine | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| T4 (L-Thyroxine) | Sigma | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| Recombinant Human CNTF | Sigma | 450-13 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm filter | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL syringe | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Petri dish | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL tube | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL tube | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm Petri dish | Dutscher | 067003 | |
| 70 µm filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Binocular microscope | Olympus | SZX7 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Scalpel | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Small surgical spoon | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 flask with filter cap | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
References
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