דור מoligodendrocytes הפוך ומדיום ממוזג לניסויים בשיתוף תרבות-שיתוף
Summary
להלן, אנו מציגים שיטה יעילה לטיהור של oligodendrocytes הפוך וייצור של מדיום אוליגודנדרוציטים ממוזג שניתן להשתמש בהם לניסויים בשיתוף התרבות.
Abstract
במערכת העצבים המרכזית, oligodendrocytes הפוך ידועים בתפקידם ב אקסון מיאלונציה, האיצה את התפשטות הפוטנציאל של הפעולה באמצעות הולכה מוכרת. יתר על כן, מספר גדל והולך של דיווחים מראים כי oligodendrocytes הפוך אינטראקציה עם נוירונים מעבר מיאלואידית, בעיקר באמצעות הפרשה של גורמים מסיסים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המאפשר טיהור של תאים oligodendroglial היוחסין מתרבויות התאים גליה גם מכיל האסטרוציטים ותאי microglial. השיטה מסתמכת על לילה רועד ב 37 ° c, אשר מאפשר התנתקות סלקטיבית של תאים oligodendroglial ותאי microglial, ואת חיסול של מיקרוגלייה על ידי הדבקה דיפרנציאלית. לאחר מכן נתאר את התרבות של oligodendrocytes הפוך וייצור מדיום ממוזג (OCM). כמו כן, אנו מספקים את קינטיקה של טיפול OCM או oligodendrocytes הפוך נוסף על נוירונים מטוהרים היפוקמאל בניסויים שיתוף תרבות, לימוד אינטראקציות אוליגודנדרוציטים-נוירונים.
Introduction
Oligodendrocytes הפוך (OLs) הם תאים גליאל של מערכת העצבים המרכזית (CN) היוצרים גלישת מיאלין סביב axons. OLs מקורם אוליגודנדרוציטים התאים הקודמי (OPCs) אשר מתרבים בתוך האזורים החדרית של ה-CN העובריים ולאחר מכן להעביר ולהבדיל ל-OLs בוגרת לחלוטין (כלומר, מיאלין ויוצרים תאים)1. OPCs הם שופע במהלך התפתחות מוקדמת, אבל גם להתמיד במוח המבוגר שבו הם מייצגים את האוכלוסייה הגדולה מתרבים תאים2. אחד משני מספר אקסונים בחלקים שאינם להתרגש (כלומר, internodes), ואת הקצה של כל לולאה מיאלין מתחבר אקסונים להרכיב את מתחם פרבודאל אשר חיוני עבור תכונות בידוד של מיאלין1,3. בין הפרפרדות ישנם פערים קטנים ללא מיאלואידית המכונים הצמתים של רנייה. צמתים אלה עשירים בערוצי נתרן מגודרת מתח (ניווט), המאפשר התחדשות והתפשטות מהירה של פוטנציאל הפעולה באמצעות הולכה המלח4. זה אינטראקציה הדוקה גם מאפשר לתמיכה באנרגיה סיבי באמצעות ספיגה עצבית של לקטט מ-OLs5,6.
ההבשלה של תאים oligodendroglial השושלת ואת תהליך מיאלונציה מוסדר בחוזקה על ידי האינטראקציות שלהם עם נוירונים7. אכן, OLs ו-OPCs, בשם גם NG2 תאים, לבטא מערך של קולטנים עצביים, והוא יכול לקבל קלט מפני הנוירונים והדיכוי הדיכוי, המאפשר להם לחוש פעילות עצבית שיכולה לעורר את התפשטות שלהם ו/או בידול לתאים מיאלואידית2. בתורו, opcs/OLs להפריש מיקרושלפוחיות וחלבונים לתוך החלל מתוך מסחטות אשר בלבד או סינגיסיסטי מתווך neuromodulative ופונקציות נוירוגינים8,9,10,11,12. עם זאת, מנגנונים מולקולריים שליטה על מצבים מרובים של אינטראקציות בין תאי השושלת oligodendroglial ונוירונים עדיין להיות מפוענח לחלוטין.
כמו-כן, במספר מצבים פתולוגיים, מושפעות בעיקר, ובכך מטרידים את האינטראקציה שלהם עם נוירונים. למשל, טרשת נפוצה (MS), תפקוד נוירולוגי נגרמת על ידי deמיקוד מוקד ב-cn, משני לאובדן OLs שיכול להוביל לנזק סיבי הצטברות נכות קשורה. מחדש יכול להתרחש, אם כי לא מספיק ברוב המקרים13. התקדמות בעשור האחרון, בשל התפתחות של טיפולים חיסוני, יש להפחית את שיעור הנסיגה אבל לקדם את השרידים מיאלונציה כדי לצאת הצורך בלתי מתקיים. ככזה, הבנה טובה יותר של התפקידים, פונקציות והשפעות הוא עניין מיוחד לפיתוח של טיפולים חדשים לספקטרום רחב של תנאי ה-CN.
כאן, אנו מתארים את שיטות הטיהור והתרבות של הולים. הדבר מאפשר בדיקה מדויקת של מנגנונים פנימיים המסדירים את התפתחותם ואת הביולוגיה. בנוסף, מאוד מועשר בתרבויות מסוג OLs מאפשרים ייצור של בינוני ממוזג (OCM), אשר ניתן להוסיף לתרבויות נוירונים מטוהרים כדי לקבל תובנה לתוך ההשפעה של גורמים מופרשים על פיזיולוגיה נוירואליות וקישוריות. יתר על כן, אנו מתארים כיצד ליישם במערכת תרבות שיתוף מחוץ לגוף החברה שבו מטוהרים oligodendrocytes הפוך ונוירונים משולבים יחד, המאפשר לטפל במנגנון הוויסות (re) מיאלונציה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לקבל מועשר ביותר oligodendroglial היוחסין תרבויות תאים מתרבויות גליה מעורבים, מותאם מתוך שיטה שפורסמה בעבר16, ואת הייצור הבא של מדיום ממוזג. טכניקה זו רועדת לא יקר, ניתן לחזור שלוש פעמים והוא אופטימלי להשיג כמות גבוהה של מטוהרים מטוהר, כמו תאים התרבות…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לרמי רוננזנו על עצתו הנבונה בעריכת כתב היד. עבודה זו ממומנת על ידי ICM, INSERM, מענק הקרן ARSEP כדי NSF, ו-Bouvet-Labruyère מחיר.
Materials
| 5-fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221-M | |
| Ethanol 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Fetal Calf Serum | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cysteine | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polyethylenimine(PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborate decahydrate | Sigma | B9876 | |
| Trypsin | Sigma | Sigma | |
| Uridine | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| T4 (L-Thyroxine) | Sigma | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| Recombinant Human CNTF | Sigma | 450-13 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm filter | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL syringe | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Petri dish | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL tube | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL tube | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm Petri dish | Dutscher | 067003 | |
| 70 µm filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Binocular microscope | Olympus | SZX7 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Scalpel | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Small surgical spoon | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 flask with filter cap | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
References
- Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).
- Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication. Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
- Freeman, S. A., Desmazières, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Birey, F., et al. Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2. Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).
- Frühbeis, C., et al. Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication. PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).
- Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem. eLife. 8, (2019).
- Sakry, D., et al. Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2. PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).
- Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors. PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).
- Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology. Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).
- Freeman, S. A., et al. Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).
- Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
- Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development. Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).
- Moyon, S., et al. Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration. Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Thetiot, M., et al. An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system. bioRxiv. , 763573 (2019).
- Dubessy, A. L., et al. Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS. Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).
- Barateiro, A., Fernandes, A. Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination. Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).
- Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazières, A. Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
- Mannioui, A., Zalc, B. Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).
