Oligodendrocytes ve Oligodendrocyte-Ko-Kültür Deneyleri için Şartlı Orta Üretimi
Summary
Burada, oligodendrositlerin saflaştırılması ve ortak kültür deneyleri için kullanılabilecek oligodendrosit şartlı ortamın üretimi için etkili bir yöntem gösteriyoruz.
Abstract
Merkezi sinir sisteminde, oligodendrocytes iyi akson miyelinasyon rolleriyle bilinir, bu tuzlu iletim yoluyla eylem potansiyellerinin yayılmasını hızlandırır. Ayrıca, raporların giderek artan sayıda oligodendrocytes myelination ötesinde nöronlar ile etkileşim öneririz, özellikle çözünür faktörlerin salgılayan yoluyla. Burada, glial hücre kültürlerinden de astrositler ve mikroglial hücreler içeren oligodendroglial soy hücrelerinin saflaştırılmasına izin veren ayrıntılı bir protokol saklıyız. Yöntem, 37 °C’de gece boyunca sallamaya dayanır, bu da üstteki oligodendrogial hücrelerin ve mikroglial hücrelerin seçici ayrılmasına ve mikroglianın diferansiyel adezyon la ortadan kaldırılmasını sağlar. Daha sonra oligodendrocytes kültürünü ve oligodendrocyte-conditioned orta (OCM) üretimi açıklar. Biz de co-kültür deneylerde saflaştırılmış hipokampal nöronlar için OCM tedavi veya oligodendrocytes ek kinetik sağlamak, oligodendrocyte-nöron etkileşimleri çalışma.
Introduction
Oligodendrocytes (OL) merkezi sinir sisteminin glial hücreleridir (CNS) aksonlar etrafında miyelin sarma oluşturmak. OL’ler, embriyonik CNS’nin ventriküler bölgeleri içinde çoğalan ve daha sonra tamamen olgun OL’lere (yani miyelin oluşturanhücrelere)göç eden ve farklılaşan oligodendrocyte öncül hücrelerinden (OPCs) kaynaklanır. OPCs erken gelişim sırasında bol, ama aynı zamanda büyük proliferatif hücre popülasyonu temsil yetişkin beyinde devam2. Tek bir OL, çıkarılabilir olmayan bölümlerde birden fazla aksonları (yani, internodes) ensheathes ve her miyelin döngü kenarı miyelin yalıtım özellikleri için çok önemli olan paranodal etki alanı oluşturan akson bağlanır1,3. Paranodlar arasında Ranvier düğümleri denilen küçük myelinated boşluklar vardır. Bu düğümler voltaj kapılı sodyum kanalları (Nav) açısından zengindir ve tuzatory iletkenlik4ile etki potansiyellerinin yenilenmesine ve hızlı yayılmasına olanak sağlar. Bu sıkı etkileşim aynı zamanda OLs 5 laktat nöronal alımıyoluyla aksonal enerji desteği sağlar5 ,6.
Oligodendroglial soy hücrelerinin olgunlaşması ve miyelinasyon süreci sıkı nöronlar ile etkileşimleri tarafından düzenlenir7. Nitekim, OLs ve OPCs, ayrıca NG2 hücreleri olarak adlandırılan, nörotransmitterler için reseptörlerin bir dizi ifade, ve uyarıcı ve inhibitör nöronlar giriş alabilirsiniz, onları miyelinating hücrelere onların çoğalma ve / veya farklılaşma tetikleyebilir nöronal aktivite algılamak için izin2. Buna karşılık, OPCs / OLs tek başına veya sinerjik nöromodülatif ve nöroprotektif fonksiyonlar8,9,10,11,12aracılık ekstrasellüler uzaya mikroveziküller ve proteinler salgılar . Ancak, oligodendroglial soy hücreleri ve nöronlar arasındaki etkileşimlerin birden fazla modları kontrol moleküler mekanizmalar henüz tam olarak deşifre olmak.
Ayrıca, çeşitli CNS patolojik koşullarda, OLs öncelikle etkilenir, böylece nöronlar ile etkileşimi rahatsız. Örneğin, Multipl Skleroz (MS), nörolojik disfonksiyon CNS fokal demiyelinasyon neden olur, aksonal hasar ve buna bağlı sakatlık birikimine yol açabilir OLs kaybı ikincil. Remiyelinasyon, çoğu durumda yetersiz olsa da13gerçekleşebilir. Son on yılda kaydedilen ilerleme, immünoterapilerin gelişmesi nedeniyle nüks etme oranını azaltmış, ancak remiyelinasyonu teşvik etmek bugüne kadar karşılanmamış bir ihtiyaç olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, OL’lerin rolünün, işlevlerinin ve etkilerinin daha iyi anlaşılması, cns koşullarının geniş bir yelpazesi için yeni tedavilerin geliştirilmesiaçısından özellikle ilgi çekicidir.
Burada, OSB’lerin arınma ve kültür yöntemlerini açıklıyoruz. Bu, gelişimlerini ve biyolojilerini düzenleyen içsel mekanizmaların hassas bir şekilde incelenmesini sağlar. Buna ek olarak, bu tür son derece zenginleştirilmiş OL kültürleri oligodendrocyte klimalı orta üretimine izin (OCM), hangi saflaştırılmış nöron kültürleri eklenebilir nöronal fizyoloji ve bağlantı üzerinde OLS gizli faktörlerin etkisi hakkında fikir edinmek için. Ayrıca, saflaştırılmış oligodendrositler ve nöronların bir araya gelerek miyelinasyonu düzenleyen mekanizmaların ele alınmasına olanak tanıyan bir in vitro co-kültür sisteminin nasıl uygulanacağını anlatıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, daha önce yayınlanmış bir yöntem 16 uyarlanmış karışık glial kültürlerden son derece zenginleştirilmiş oligodendroglial soy hücre kültürleri elde etmek için ayrıntılı bir protokol sağlamak16, ve OL-klimalı orta sonraki üretim. Bu sallayarak tekniği pahalı değildir, üç kez tekrarlanabilir ve saflaştırılmış OL’lerin yüksek miktarda elde etmek için en uygun, Bottenstein-Sato kültürlü hücreler olarak (BS) ortamda PDGFα çoğalır. Glial hücreler P2 Wis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Rémi Ronzano’ya el yazması düzenlemedeki bilge tavsiyeleri için teşekkür etmek isterler. Bu çalışma ICM, INSERM, NSF’ye ARSEP vakfı hibesi ve Bouvet-Labruyère fiyatı ile finanse edilmiştir.
Materials
| 5-fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221-M | |
| Ethanol 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Fetal Calf Serum | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cysteine | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polyethylenimine(PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborate decahydrate | Sigma | B9876 | |
| Trypsin | Sigma | Sigma | |
| Uridine | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| T4 (L-Thyroxine) | Sigma | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| Recombinant Human CNTF | Sigma | 450-13 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm filter | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL syringe | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Petri dish | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL tube | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL tube | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm Petri dish | Dutscher | 067003 | |
| 70 µm filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Binocular microscope | Olympus | SZX7 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Scalpel | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Small surgical spoon | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 flask with filter cap | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
References
- Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).
- Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication. Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
- Freeman, S. A., Desmazières, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Birey, F., et al. Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2. Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).
- Frühbeis, C., et al. Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication. PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).
- Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem. eLife. 8, (2019).
- Sakry, D., et al. Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2. PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).
- Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors. PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).
- Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology. Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).
- Freeman, S. A., et al. Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).
- Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
- Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development. Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).
- Moyon, S., et al. Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration. Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Thetiot, M., et al. An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system. bioRxiv. , 763573 (2019).
- Dubessy, A. L., et al. Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS. Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).
- Barateiro, A., Fernandes, A. Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination. Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).
- Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazières, A. Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
- Mannioui, A., Zalc, B. Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).
