Identificatie van Hosttrajecten die zijn getarget door bacteriële Effector eiwitten met behulp van gist toxiciteit en suppressor schermen

Het eerste rapport van procedures vergelijkbaar met die hier gepresenteerd gekenmerkt de Legionella pneumophila type IV Effector Sidd, een deAMPylase dat wijzigt Rab1¹. Er werden vergelijkbare technieken gebruikt voor de karakterisering van verschillende L. pneumophila Effectors^1,2,3. De assay werd aangepast om een Coxiella burnetii type IV Effector proteïne⁴te karakteriseren, en onlangs werd het nut van deze techniek uitgebreid voor de karakterisering van Chlamydia trachomatis inclusie membraan eiwitten⁵ .

Dit protocol kan worden opgesplitst in twee belangrijke delen: 1) het gist toxiciteits scherm, waarin de bacteriële Effector proteïne van belangstelling wordt uitgedrukt in gist en klonen worden gescreend op een toxisch fenotype zoals blijkt uit een groei fout, en 2) het gist suppressor-scherm , waarin het toxische fenotype wordt onderdrukt door uitdrukking van een gist genomische bibliotheek in de toxische stam. Zo is het toxiciteits scherm een scherm voor toxische fenotypes dat zich manifesteert als groei fouten wanneer de bacteriële Effector van belang wordt overexpressie. Giftige klonen, succesvol getransformeerd met en uitdrukken van de bacteriële Effector, worden geselecteerd en opgeslagen voor de volgende stap. De tweede belangrijke stap is het overdrukken van een gedeeltelijk verteerde gist genomische bibliotheek in de giftige gist kloon. Plasmiden maken van de gist genomische Library voorgesteld voor het gebruik in dit protocol dragen 5 − 20 KB inserts, meestal overeenkomend met 3 − 13 gist open reading frames (ORF) van een gemiddelde gengrootte van ~ 1,5 KB over alle plasmiden, die het hele gist genoom bedekt ongeveer 10x. Dit deel van de test wordt het suppressor scherm genoemd, omdat het doel is om de toxiciteit van het bacteriële Effector eiwit te onderdrukken. Potentiële suppressor plasmiden zijn geïsoleerd van gist, Sequenced, en het onderdrukken van Orf’s geïdentificeerd. De ratio die aan het onderdrukker scherm ten grondslag ligt, is dat de Effector proteïne bindt, samenwerkt met, en/of overweldt van componenten van het ontvangende pad dat het target, en dat het verstrekken van die gastheer eiwitten terug in overmaat het toxische effect op het traject kan redden en dus, de groei fout. Zo, geïdentificeerde Orf’s die toxiciteit onderdrukken vaak vertegenwoordigen meerdere deelnemers van een host-traject. Orthogonale experimenten worden vervolgens uitgevoerd om te controleren of de bacteriële Effector inderdaad met het betrokken traject samenwerkt. Dit is vooral nodig als een bindende partner zoals clathrin of actine is geïdentificeerd, omdat deze eiwitten betrokken zijn bij een veelheid van hostprocessen. Verdere experimenten kunnen dan de fysiologische functie van het Effector eiwit verheldoen tijdens infectie. De toxiciteits-en suppressor schermen zijn ook krachtige hulpmiddelen voor het ontcijferen van de fysiologische functie van bacteriële Effector eiwitten die niet fysiek gastheer eiwitten binden met affiniteiten die voldoende zijn om te detecteren door immunoprecipitatie of die interageren met de host in enzymatische hit-and-run interacties die mogelijk niet worden gedetecteerd door een gist-twee hybride scherm.

Hoewel het suppressor-scherm een krachtige methode kan zijn om potentiële fysiologische interacties tussen bacteriële Effector eiwitten en hosttrajecten te onthullen, moet het bacteriële Effector eiwit een groei fout in gist induceren, anders gebruikt het in de het onderdrukker scherm zal weinig gebruikt worden. Bovendien moet het toxische fenotype resulteren in ten minste een 2 − 3 log₁₀ -tekort in groei of het zal moeilijk zijn om suppressors te identificeren. Als een laboratorium is opgezet voor celkweek, screening Effector eiwitten voor toxiciteit in gemeenschappelijke cellijnen zoals HeLa kan vaak inzicht geven of het de moeite waard om door te gaan met de gist toxiciteit scherm. Ectopische uitdrukking van het Effector-eiwit in HeLa-cellen leidt soms tot toxiciteit die zeer sterk correleert met de toxiciteit in de gist stam die voor deze schermen wordt gebruikt⁴. Waarneembare kenmerken van stress in HeLa-cellen zijn verlies van stress vezels, celloslating van de plaat en nucleaire condensatie die apoptosis aangeeft. Elke visuele indicatie van stress in HeLa-cellen maakt het eiwit van belang een goede kandidaat voor het induceren van een groei fout in gist, die veel sneller repliceert en dus beter reageert op perturbatie van essentiële trajecten.

Opgemerkt moet worden dat het onderdrukker scherm niet altijd host binding partners identificeert als onderdrukkers, maar het kan nog steeds cruciale componenten van de beoogde host-traject (en) impliceren, wat een holistisch beeld oplevert van de biologische processen die worden gekaapt door de bacteriële Effector eiwitten. Op het oppervlak, dit lijkt contra-intuïtief, omdat het verstrekken van de bindende partner van de Effector eiwit in overmaat zou worden verwacht dat de groei defect te redden. Bij inspanningen om trajecten te identificeren die zijn getarget door de C. trachomatis Effector Protein CT229 (cpos), die bindt aan ten minste 10 verschillende Rab GTPases tijdens infectie⁵, onderdrukte geen van de bindende partners van Rab de toxiciteit van CT229. Er werden echter talrijke onderdrukkers geïdentificeerd die betrokken waren bij de handel met clathrin-Coated blaasje (CCV), wat leidde tot verder werk dat aantoont dat CT229 in het bijzonder Rab-afhankelijke CCV-mensenhandel ondermijnt. Evenzo, bij het onderzoeken van de C. burnetii Effector Protein Cbu0041 (CIRA) verschillende Rho gtpases die de gist groei defect gered werden geïdentificeerd, en het werd later gevonden dat CIRA fungeert als een GTPase activeren eiwit (Gap) voor rhoa⁴.

Het nut van de gist suppressor scherm voor verhelderende gastheer trajecten doelwit van bacteriële Effector eiwitten kan niet worden overschat, en andere onderzoekers proberen te karakteriseren intracellulaire bacteriële Effector eiwitten kunnen sterk profiteren van deze technieken. Deze assays zijn van waarde als immunoprecipitaties en/of gist-twee hybride schermen hebben nagelaten een bindende partner te vinden en kunnen verheldoen welke trajecten zijn gericht op het bacteriële Effector eiwit. Hier, gedetailleerde protocollen voor de toxiciteit en suppressor schermen om gastheer biologische trajecten doelwit van intracellulaire bacteriële Effector eiwitten identificeren, evenals enkele van de gemeenschappelijke obstakels ervaren bij het gebruik van deze testen en hun bijbehorende oplossingen.